[发明专利]快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法

权利要求书

1.一种快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对菘蓝种子进行催芽，萌发长至整株幼苗的长度为2-3cm后分配到土盆中；

(2)活化携带有目的基因的发根农杆菌；步骤(1)和步骤(2)无时间上的顺序；

(3)当菘蓝幼苗茎粗至0.2-0.6cm时，使用一次性注射器吸取步骤(2)的发根农杆菌菌液创伤侵染幼茎；

(4)注射苗放置在湿度为75％-90％的环境下培养7-8天，直至伤口周围萌蘖出不定根并开始分化出根毛；

(5)使用激光共聚焦显微镜检测外源目的基因表型的表达状况，筛选阳性外植体，所述阳性外植体为毛状根；

(6)消毒后将阳性外植体接入诱导再生培养基，经历诱导愈伤、愈伤增殖、愈伤分化出芽和根；

(7)愈伤组织分化出根后，芽的生长速度下降，挑选分化状态良好的幼芽接入生根培养基生成完整再生植株；

(8)通过PCR和WesternBlot验证再生植株外源目的基因和蛋白表达量以筛选阳性转基因苗；

(9)将阳性转基因苗经过炼苗移栽到土盆中；

所述步骤(1)中，使用40℃温水浸泡菘蓝种子后，放置在37℃环境下始终保持湿润的滤纸上完成催芽；

步骤(2)中，以mCherry基因作为目的基因，将携带目的基因的表达载体35S：mCherry-pROK2转化到发根农杆菌中；所述发根农杆菌为K599；

步骤(2)中，带有目的基因的发根农杆菌在-80℃冰箱中保存，使用时，使用YRK固体培养基进行活化；所述YRK固体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素、50-100mg利福平和10g琼脂；

步骤(2)具体为：使用牙签蘸取菌液在YRK固体培养基划线后密封，放置在28℃下培养12-16h，长出的单菌落为活化菌落，挑取单菌落转移至5mlYRK液体培养基后在28℃、150r摇床培养；所述YRK液体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素和50-100mg利福平；

步骤(3)所述发根农杆菌菌液OD值为0.9；注射点距菘蓝幼苗茎基1cm，注射器以45°角度将菌液注入菘蓝幼苗茎中，并在伤口残留菌株，以提高转化诱导的效率；

步骤(4)中，注射苗培养的环境条件为：光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时，并且需要保持育苗盆环境湿度为75％；

步骤(5)中，通过激光共聚焦检测目的基因mCherry的表达，mCherry的最大吸收和发射峰分别位于587nm和610nm；

步骤(6)中，阳性外植体接入诱导再生培养基的过程在超净台中完成，所使用的全部器皿工具均进行消毒处理；对阳性外植体消毒的方法为：酒精浸泡30s，灭菌水冲洗1次，7％次氯酸钠浸泡2min，灭菌水冲洗5次；诱导再生培养基为：每升基础培养基+1mg萘乙酸+2mg 6-苄氨基嘌呤+500mg水解乳蛋白+700mg脯氨酸+30g蔗糖+8g琼脂，调至PH为5.8；

步骤(7)中，生根培养基为：每升基础培养基+0.1mg吲哚丁酸+0.005mg萘乙酸+30g蔗糖+8g琼脂，调至PH为5.8；

所述基础培养基的配方为：每升基础培养基中含有硝酸钾23.75g、硝酸铵20.625g、硫酸镁4.625g、磷酸二氢钾2.125g、氯化钙44g、乙二胺四乙酸二钠3.73g、硫酸亚铁2.78g、硼酸6.2g、硫酸锰16.9g、硫酸锌8.6g、钼酸钠0.25g、硫酸铜25mg、氯化钴25mg、碘化钾0.83g、甘氨酸800mg、盐酸硫胺素40mg、盐酸吡哆素200mg和肌醇20g；

步骤(8)中，阳性转基因苗的鉴定方案为：取所述再生植株的叶片，通过CTAB法提取叶片总RNA，通过反转录试剂盒得到总DNA；

以所得总DNA为模板通过PCR检测外源目的基因mCherry是否表达；

步骤(9)中，炼苗为：培养间无菌环境打开组培瓶培养三到五天后，洗净培养基移入土盆中；炼苗培养条件如下：各组分的体积比为，营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1，光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时。