[发明专利]肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法

说明书

本发明提出了一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：S1、差异裂解去宿主：取样离心弃上清，重悬于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入无菌水再次孵育；加入NaCl震荡均匀后离心弃上清，重新悬浮于PBS溶液中；S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，经历黑暗孵育以及光照孵育；S3、微生物菌体破壁：采用研磨珠以及溶菌酶对S2中得到的溶液进行破壁处理；S4、核酸提取：对S3得到的溶液进行DNA提取，并检测质量。本发明通过使用叠氮溴化丙锭(PMA)。当暴露在可见光下时，PMA分子的叠氮基被光解裂解，并发生C‑H插入反应，与DNA形成共价键，可有效地从下游分析中消除任何暴露的DNA。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法。

背景技术

全面检测、无偏好性的宏基因组二代测序(mNGS)在传染病诊断方面具有强大的优势，因为不需要特殊探针和靶向引物，从而有助于快速检测病原体。随着成本和时间的持续减少，mNGS越来越多地用于临床诊断。然而，由于宿主DNA的高背景大大降低了病原体的序列覆盖率，在大多数临床标本中，人类DNA污染仍然是mNGS中病原体检测的主要挑战。先前对急性下呼吸道感染患者鼻咽抽吸物进行的宏基因组学研究表明，高达95％的原始NGS读数是人类DNA。可使用商用试剂盒和已发布的方法(包括差异裂解，去除人类DNA和微生物DNA富集方法)进行去宿主处理，但它们在复杂的呼吸道样本中表现不佳，需要更好的方法。

当前去除宿主DNA的方法可分为两大类：在DNA提取之前起作用的方法和在提取后作用于DNA的方法。第一种方法通常遵循两步过程：第一步是选择性裂解哺乳动物细胞；第二步通过酶去除暴露的DNA，仅留下完整的微生物细胞用于下游分析。虽然成本较低，但对样本要求较高，会引起提取得到的微生物样本量不足等问题。第二种方法主要有两种形式的处理方法：一种方法是针对甲基化核苷酸，但这种方法不适用于具有与宿主相似的甲基化模式的真核微生物；另一种方法是利用CRISPR/Cas9针对宿主特异性序列进行基于杂交的缺失，这种方法已经成功地应用于高度重复的rRNA序列，但不容易适应基因组规模的序列耗尽。

因此急需提供一种应用于呼吸道样本，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低的病原微生物宏基因组去宿主化核酸提取方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了肺泡灌洗液病原微生物宏基因组去宿主化核酸提取方法，对临床标本进行预处理，以选择性地消耗人类DNA，同时将对病原体DNA的影响降至最低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：

S1、差异裂解去宿主：取样离心弃上清，重悬于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入无菌水再次孵育；加入NaCl震荡均匀后离心弃上清，重新悬浮于PBS溶液中；

S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，经历黑暗孵育以及光照孵育；

S3、微生物菌体破壁：采用研磨珠以及溶菌酶对S2中得到的溶液进行破壁处理；

S4、核酸提取：对S3得到的溶液进行DNA提取，并检测质量。

进一步地，所述S1中差异裂解去宿主具体包括如下步骤：

S11、将肺泡灌洗液样品(400μL)以10,000g离心5min，去掉上清液，并将沉淀重新悬浮在200μLPBS中；

S12、加入5％皂苷溶液，震荡混匀并在室温下孵育10min；

S13、孵育后，添加300μL无菌水，并在室温下继续孵育30s，然后添加10μL 5MNaCl，振荡混匀；