[发明专利]一种稻曲病菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种稻曲病菌的分离方法。该方法采用一种特别的孢子分散丝与孢子分散板配合，直接从稻曲病病稻粒中将单个厚垣孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻曲病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)稻曲病标样的采备；2)孢子分散丝的制备；3)孢子分散板的制备；4)厚垣孢子的滑散；5)离散单厚垣孢子的切出；6)单孢子的培养与单孢子菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高稻曲病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种稻曲病菌的分离方法。

背景技术

稻曲病是我国水稻生产的一种重大病害，该病害由稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)侵染引起。开展稻曲病菌的生物学研究是稻曲病防控的重要基础。要开展稻曲病菌的生物学研究，首先要获得稻曲病菌，也就是要从田间的病害标样中将稻曲病菌分离出来，获得稻曲病菌的纯培养。

稻曲病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的稻曲病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。因此在取得初步分离纯培养的基础上，通常需要进行进一步的单孢分离培养才能取得合格的菌株材料。

至今已有公开多种稻曲病菌的分离方法，主要是组织分离培养方法和厚垣孢子(厚壁分生孢子)分离培养方法。

组织分离培养方法的主要技术特征是，需要将带菌组织进行表面消毒，再将消毒后的组织块转移到培养基上培养。该方法一般需要操作较多的组织块，消耗标本量多；重要的是不能确定分离获得的纯培养菌是否属于遗传组成单一的稻曲病菌。

厚垣孢子分离方法，包括悬浮液法与敲落法。前者通过水介质配成孢子悬浮液后转到培养基上培养的方法；后者敲震稻曲球将孢子直接敲落到培养基上培养的方法。这些方法分离获得的培养菌也不能明确是否属于遗传组成单一的稻曲病菌。

也有公开采用挑孢针直接在显微镜下挑取单孢子进行培养的分离方法，但由于普通显微镜的成像是实物的反向成像，显微镜下操作动作也是反向的，因此该方法需要特殊的操作训练，或者说需要操作人员有较深厚的反向显微操作技术功底。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得遗传组成单一的稻曲病菌纯培养的分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻曲病菌的分离方法，采用一种特别的孢子分散丝与孢子分散板配合，直接从稻曲病病稻粒中将单个厚垣孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻曲病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.稻曲病标样的采备：在稻曲病发病期间到田间采集稻曲病标样，采摘干净、黄色的成熟稻曲球于干净的培养皿内，带回实验室，置于4℃冷藏箱存放备用。

2.孢子分散丝的制备：取无墨水的圆珠笔笔芯在火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离稻曲病菌厚垣孢子使用的孢子分散丝，该分散丝包括滑动丝a1、丝杆a2部分。

3.孢子分散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用。

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板。