[发明专利]一种猫冠状病毒S重组蛋白及其制备方法

说明书

本公开提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。本公开还提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；(b)将S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞；(c)将质粒和原核表达载体连接，得到重组质粒。(d)将重组质粒转化至BL21进行原核表达，得到猫冠状病毒S重组蛋白。本发明人首次发现了位于FCoV S2蛋白中的蛋白片段具有良好的反应原性和免疫原性，可作为后续研究和开发FCoV疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。

技术领域

本公开涉及基因重组的技术领域，尤其涉及一种猫冠状病毒S重组蛋白及其制备方法。

背景技术

猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)引起的慢性致死性疾病，以腹膜炎、大量腹水积聚或各脏器出现肉芽肿病变为主要特征，不同年龄的猫均可感染，但老龄猫和2岁以内的猫发病率较高，纯种猫发病率高于一般品种的家猫，传染率非常高。FCoV为不分节段、单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovi-rale)，冠状病毒科(Coronaviridae)，α冠状病毒(Alphacoronavirus)。FCoV有11个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，以及7种非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a、7b，和复制酶1a和1b。冠状病毒S蛋白全长为12-24nm，呈穹顶状，排列方式类似于王冠样，是病毒表面最大的结构蛋白。S蛋白是机体识别病原的主要靶蛋白，它能够介导病毒与宿主细胞的识别以及侵入过程的膜融合。研究表明，S蛋白在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用，是基因工程疫苗和诊断技术等方面研究中是最重要的一个靶蛋白。S蛋白包括S1和S2功能域。其中，S1功能域含有受体结合区域RBD以及大量抗原表位区域，然而S1功能域变异性较高，不利于作为靶蛋白区域；而S2功能域是S蛋白中较为保守的部分，介导病毒和细胞膜的融合，且含有丰富的抗原表位。

本发明人通过生物信息学软件预测分析FCoV S蛋白。根据亲水性、表面极性、抗原性以及二级结构特征等，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性，可作为后续研究冠状病毒的新蛋白材料。

发明内容

本公开提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白，可作为后续研究FCoV及开发FCoV药物的基础。

本公开还提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法。

根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；

(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；

(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S；

(d)将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。