[发明专利]一种链霉亲和素磁珠及其制备方法

说明书

本发明公开了一种链霉亲和素磁珠及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：步骤一、羧基磁珠的活化；步骤二、羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；步骤三、物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。本发明方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，活性强，偶联效率高，与传统方法相比，偶联效率由58.2%提高到92.7%。

技术领域

本发明涉及一种链霉亲和素磁珠及其制备方法。

背景技术

链霉亲和素磁珠因与生物素标记配体，如生物素标记核酸、抗体或细胞表面蛋白等有高效地结合力，被广泛应用于生物研发及应用领域，然而链霉亲和素在与磁珠偶联时时常发生附着式地物理连接，不能稳定地与磁珠结合，特别是在后期应用时，经对磁珠地反复冲洗，时常发生链霉亲和素从磁珠上剥离的现象。同时，链霉亲和素由于是一种活性物质，偶联磁珠时极易发生失活现象，导致后期链霉亲和素磁珠的低结合效率。因此，一种高效稳定地将链霉亲和素偶联到磁珠的方法亟待研发。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，该方法制得的链霉亲和素磁珠稳定性好，偶联效率高，偶联效率高达92.7%。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效链霉亲和素磁珠的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，羧基磁珠的活化；

步骤二，羧基磁珠与链霉亲和素的共价偶联；

步骤三，物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测；

步骤四，链霉亲和素磁珠的淬灭及保存。

进一步的，所述步骤一中羧基磁珠活化的方法如下：（1）取羧基磁珠原液于EP管中，置于磁力架上磁珠分选两分钟，去除保存液；（2）加入 0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠两次，磁珠分选去上清；（3）加入现配现用的5mg/mL NHS和5mg/mL BOP溶液37℃旋转孵育2小时，活化磁珠表面的羧基；（4）活化后磁珠分选2min，并加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠3次，去除活化剂。

进一步的，所述步骤二中羧基磁珠与链霉亲和素共价偶联的方法如下：（1）将步骤一活化后的羧基磁珠放于偶联缓冲液中,加入链霉亲和素，室温旋转孵育至少3小时，磁珠分选去上清；（2）加入0.01M 磷酸盐缓冲液清洗磁珠三次，加入500uL 0.01M 磷酸盐缓冲液重悬磁珠。

进一步的，所述步骤三中物理式附着结合的链霉亲和素的剥离及检测的方法如下：（1）将步骤二中得到的偶联过链霉亲和素的磁珠放入微量透析装置（截留分子量应大于70K）,透析液为0.01M 磷酸盐缓冲液，期间每4小时换透析液一次，磁力搅拌透析24h；（2）透析完成后，将透析装置放于离心管中，1500g离心1分钟；（3）收集离心液做Western blot，用HRP标记的生物素作为检测抗体，检测物理式附着结合的链霉亲和素是否从磁珠上完全剥离；（4）将剥离后的磁珠与链霉亲和素偶联缓冲液再次孵育，填补剥离后空缺的—COOH位点，孵育后再用0.01M 磷酸盐缓冲液进行三次磁珠分选清洗。

进一步的，所述步骤四中链霉亲和素磁珠的淬灭及保存的方法如下：（1）在步骤三获得的链霉亲和素磁珠中加入淬灭缓冲液，轻柔混合，在旋转器上孵育45分钟；（2）用磁力架收集磁珠，去除上清；（3）添加保存液进行保存；其中，淬灭缓冲液为0.638mL乙醇胺加10mL 磷酸盐缓冲液 配制而得；保存液为 1g酪蛋白、2g蔗糖加入100mL 磷酸盐缓冲液配制而得。

进一步的，所述偶联缓冲液的配制如下：取链霉亲和素、BOP试剂加入硼酸盐缓冲液，其中硼酸盐缓冲液是由10% 0.05 M 的 Na₂B₄O₇溶液和90% 0.2 M 的H₃BO₃溶液配制而成，最终pH 值为 7.4，灭菌后4℃保存备用。