[发明专利]枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物，分别作为胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的内侧引物对，以待测样品基因组DNA为模板进行两轮PCR扩增后对扩增产物进行电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。本发明的方法对胶孢炭疽菌、尖孢炭疽菌基因组DNA的检测灵敏度高，特异性强，实用性好，可用于快速、准确和灵敏地检测枇杷叶片中微量的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，对枇杷炭疽病的早期诊断和精准防治具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及枇杷炭疽病菌的检测，具体涉及一种枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物及其检测方法和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)是一种起源于中国的亚热带常绿果树，因其风味独特、营养丰富、具药用价值而深受消费者喜爱，但随着其种植面积增大，病害问题突显，其中枇杷炭疽病是一种发病率最高、发病范围最广的病害，严重制约了产业发展。该病害主要为害枇杷叶片、果实，造成叶斑和果实软腐症状，且危害时间长，从生长发育至采后贮藏时期均可发病，为果农和经销商带来了巨大的经济损失。

枇杷炭疽病主要由真菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)侵染所致，其分生孢子一般从伤口、气孔等入侵，有时也可以直接穿透表皮入侵。分生孢子借助风、雨、昆虫等媒介进行传播，其孢子萌发的适宜温度为20-30℃，其中在25℃时萌发率最高；适宜相对湿度为90％以上，在饱和湿度和水滴中的萌发率最高，为72.35％。孢子萌发后可产生芽管，芽管与寄主表面接触后顶端膨胀形成附着胞附着于寄主表面，从附着胞的下方产生菌丝通过细胞间隙对寄主细胞进行侵染。

由于未成熟枇杷中绿原酸含量较高，同时含有的一些抑菌物质能够钝化病原菌分泌的水解酶，所以病原菌的附着胞通过皮孔侵入枇杷后不会立即产生侵入菌丝，而是埋藏在枇杷表皮或角质层内，静止休眠可达数月，表明炭疽病菌具有潜伏侵染的特性，若在田间观察到病症再进行防治已为时过晚。因此，建立一种快速、准确的枇杷炭疽病菌分子检测技术十分必要。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物，分别作为胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的内侧引物对，以待测样品基因组DNA为模板进行两轮PCR扩增后对扩增产物进行电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物，其特征在于：所述枇杷炭疽菌为枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)或枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)；

所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’；

所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’。

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Ca1F:5’-ACCCTTTGTGACATACCTAACC-3’；

所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’。

本发明的一个实施方案，巢式PCR的检测过程中，

所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的上游引物：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的下游引物：