[发明专利]南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

本发明提供了一种南松大小蠹的检测方法，经试验筛选的特异性引物(NS‑F和NS‑R)和探针(NS‑P)组合在Taq‑Man实时荧光定量PCR方法中可达到鉴定南松大小蠹的目的。本发明适用于不同状态大小蠹的检疫鉴定，弥补了常规形态学鉴定方法的不足，与现有技术中运用的DNA条形码鉴定技术相比，引物和MGB探针特异性强、灵敏度高、实验操作简单、用时短；鉴定结果直观，观察扩增曲线即可得出结果。本研究不但能满足进出境原本的快速通关的要求，提高检出率，同时能够有效预防危险性大小蠹的入侵和扩散，对保护我国农林业生产和生态安全具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物物种分子鉴定技术领域，涉及一种大小蠹的实时荧光PCR检测方法，具体涉及南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及其应用；此外，本发明还涉及检测南松大小蠹的引物和探针。

背景技术

大小蠹属Dendroctonus隶属于鞘翅目Coleoptera、象甲科Curculionidae、小蠹亚科Scolytinae，是一类重要的森林生态系统蛀干害虫，其主要对松属、云杉属、黄杉属等林木造成危害，该属(非中国种)已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。全世界大小蠹属已知共20种，其中中、北美洲分布18种，欧洲、亚洲现分布3种。大小蠹属非中国种害虫南松大小蠹Dendroctonus frontalis原产于美国，不仅是危害松类针叶树种的蛀干害虫，而且传播蓝霉菌，破坏传播水分的木质部，造成树木死亡。

研究结果表明，南松大小蠹在我国可能适宜定殖的地区范围较广，包括安徽中北部、湖北中北部、四川部分地区、云南部分地区、山西南部等。随着我国对外贸易的日益频繁，进口木材数量与日俱增，口岸截获的害虫种类和数量不断增加，故对其进行快速准确的检疫鉴定对预防检疫性种类入侵有重要的意义。

目前针对大小蠹属种类，基于外部形态特征进行鉴定仍是检疫系统最常用的方法。然而，形态学鉴定主要以成虫为研究对象，口岸截获的大小蠹中有相当一部分为幼虫，蛹或者部分破碎的成虫，使得形态学鉴定难以实现准确鉴定。不仅如此，大小蠹属害虫的种间形态相似，差异较小，鉴定较为困难，对鉴定人员经验和分类基础要求较高。因此，探索新的方法弥补形态鉴定的不足显得尤为重要和迫切。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，如DNA条形码技术、常规PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术、限制性片段长度多态性(RFLP)技术及微卫星技术等多种技术逐渐应用于物种的分子鉴定方法当中。但国内对于大小蠹的分子鉴定技术研究报道仍旧较少，殷玉生等基于线粒体COI基因对我国口岸经常截获的6种大小蠹属昆虫快速鉴定的可行性和准确性进行了研究(详见：殷玉生，张帆，安榆林.基于线粒体COI基因鉴定大小蠹属昆虫[J].福建林业科技，2014，41(01)：63-67.)；花婧等通过线粒体COI基因867bp片段序列对大小蠹属17个种类进行序列分析，表明COI基因可作为大小蠹属昆虫分类的依据(详见：花婧，郑斯竹，安榆林，杨晓军.基于线粒体COⅠ基因的大小蠹属昆虫DNA条形码研究[J].江苏农业科学，2014，42(03)：30-32.)；田虎等基于DNA条形码技术表明mtDNA COI基因5'端和3'端序列均可有效区分红翅大小蠹与黑脂大小蠹(详见：田虎，于培文，娄巧哲，徐志彬，杨晓丽，王新军，郝常，郭扬振.基于DNA条形码的红翅大小蠹和黑脂大小蠹分子鉴定[J].植物检疫，2020，34(01)：30-34.)。但目前大小蠹分子鉴定尚未进行实时荧光PCR快速鉴定技术研究。