[发明专利]一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种重组慢病毒载体、2019‑nCoV假病毒及其制备和应用，通过对慢病毒骨架改造，剔除其元件：CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因和WPRE，并以linker序列连接组装而形成的新型病毒表达载体，其大小较原始骨架缩小约十分之三，从而可有效提高慢病毒骨架插入外源基因的容量。将其应用于假病毒的制备中，在此基础上建立的SARS‑CoV‑2假病毒，可降低其生物安全风险、提高效率的同时节省了制备时间以及人力成本；采用本发明制备得到的SARS‑CoV‑2假病毒无致病性，具有安全性好，制备效率高，纯度高，且质控方法准确可靠等特性，可长期稳定大量制备，为后续临床广泛应用提供良好基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重组慢病毒载体、2019-nCoV假病毒及其制备和应用。

背景技术

由于天然的病毒存在潜在的传染危险性以及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品；例如cDNA、质粒DNA、裸露的RNA以及体外转录的RNA、灭活的病毒颗粒，都难以达到试验要求，所以研制稳定的、无生物传染性的质控物和标准品，不但对RNA病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。

病毒样颗粒(Virus like particle，VLP)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，但可以组装成颗粒样结构，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，具有很强的免疫原性及很好的安全性。在体外通过特殊方法将病毒样颗粒与重组质粒DNA融合，转录成的重组RNA包入病毒样颗粒内，即形成假病毒(pseudovirus)。假病毒具有模拟真病毒结构、能够抵抗核酸酶降解、稳定、安全性高等优点，给目前RNA病毒检测研究工作提供了一种强有力的工具。

利用野生型病毒株研究病毒的生物学特性及其与宿主细胞相互作用的机制是病毒学领域常用的研究方法，但前提条件是此类病毒能够在体外培养，且传染性和致病性低，对人身安全和环境不构成威胁。对于一些传染性强、致死率高，体外培养难以获得，且需在高级别生物安全实验室操作的病毒，如SARS-CoV-2(2019-nCoV)、SARS-CoV及MERS-CoV均为高致病性冠状病毒，针对这3种病毒的实验操作需要在具备相应资质的生物安全三级实验室内开展，这成为制约药物和疫苗研发的瓶颈。基于反转录病毒或HIV骨架的假病毒可在较大程度上替代真病毒进行药物筛选(限于阻止病毒侵入细胞的药物)和疫苗评价，具有较高安全性且检测方便。但影响假病毒包装效率的因素很多，包括包装骨架质粒的结构、病毒包膜蛋白的表达水平、转染前细胞的生长状态、包装质粒组合比例、质粒转染效率、细胞培养液的血清含量、假病毒上清的收集时间等多种因素。

由于新冠病毒的核酸序列约29kb～30kb，而慢病毒载体一般只能容纳不超过4kb的外源基因序列。如果要把所有的新冠病毒序列都克隆到慢病毒载体里做成假病毒，需要分成7-8个克隆，工作量特别大，且会带来一系列效率低、纯度低的缺陷。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种重组慢病毒载体。

具体技术方案如下：

一种重组病毒载体，所述重组慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-puro为骨架，通过剔除其元件：CMV promoter、EF1a promoter、puroR抗性基因和WPRE，并以linker序列连接组装而成。

在其中的一些实施例中，上述linker序列如SEQ ID NO.1所示；或为与SEQ IDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的目的之一还在于提供一种上述重组慢病毒载体在假病毒制备中的应用。

本发明的目的之一还在于提供一种假病毒的制备方法。

实现上述目的的技术方案如下：