[发明专利]HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用在审
| 申请号： | 202110436779.1 | 申请日： | 2021-04-22 |
| 公开（公告）号： | CN113201499A | 公开（公告）日： | 2021-08-03 |
| 发明（设计）人： | 孙筱放;程怡;何丽娜;宋兵;杨影虹 | 申请（专利权）人： | 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心;广州柔济医院） |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/90;C12N15/864;C12Q1/02;C12R1/91 |
| 代理公司： | 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 | 代理人： | 林青中 |
| 地址： | 510170 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | hbb 基因 cd17 突变 细胞 及其 制备 方法 应用 | ||
1.制备HBB基因CD17突变细胞的方法，其特征在于，包括：
i)使用RNP复合体靶向切割细胞的基因组DNA的HBB基因，所述RNP复合体包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA和Cas9蛋白；
ii)使用含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA与处理后的基因组DNA进行同源介导修复。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源DNA通过rAAV递送至所述细胞以进行同源介导修复。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述rAAV血清型是Ⅵ号血清型。
4.根据权利1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述外源DNA的核苷酸序列为SEQ IDNO:2所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNP复合体中，所述sgRNA与所述Cas9蛋白的摩尔比为(2～3):1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA与所述Cas9蛋白以电转染的方式导入所述细胞，转染体系中比例，1nmol Cas9蛋白对应(0.5～1.5)×105个所述细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，电转的条件为1500V～1700V，8ms～12ms，2pulse～4pulse。
8.根据权利要求1～3、5～7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为红系细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞为HUDEP-2细胞。
10.权利要求1～9任一项方法制备得到的HBB基因CD17突变细胞。
11.权利要求10所述的HBB基因CD17突变细胞在鉴别和/或测试药物中的用途；
所述药物用于预防和/或治疗β-地中海贫血和/或β-地中海贫血相关的并发症。
12.组合产品，其特征在于，包括核苷酸如SEQ ID NO:1的sgRNA、Cas9蛋白或编码其的核酸片段，以及含有CD17 A＞T突变位点位的外源DNA。
13.根据权利要求12所述的组合产品，其特征在于，所述外源DNA包装于Ⅵ号血清型rAAV中。
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