[发明专利]一种酸性蛋白酶高效表达的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种酸性蛋白酶高效表达的方法及其应用，属于基因工程领域。本发明提供的重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K‑en‑αSP‑acidprotea表达酶活达到5395U/mL，较含有原始α‑信号肽的对照菌株产酶酶活提高了109％，本发明的酸性蛋白在pH1‑5范围内，该酶能够维持其60％以上的酶活力、20～40℃处理30min剩余酶活在80％以上，可适用于食品、饲料或酿造等行业。根据本发明的技术方案可以实现利用基因工程手段生产适合工业应用的酸性蛋白酶。

技术领域

本发明涉及一种酸性蛋白酶高效表达的方法及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，其在植物、动物和微生物中都有广泛存在。相比于动植物来源的蛋白酶，微生物源蛋白酶，具有培养方便、操作简单和产酶量高的特点，便于工业化的批量生产得以大规模生产应用。因此，微生物源蛋白酶成为了目前的蛋白酶的重要来源。

蛋白酶的分类方式有很多，按照蛋白酶作用的pH，将其分成酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。酸性蛋白酶通常在pH 2.0～6.0之间是稳定的，最适pH值随种属不同稍有不同，但通常都在pH 3.0左右，如真菌所产酸性蛋白酶的最适pH为3.0，灰绿青霉菌为pH3.5，酵母菌也在pH 3.0。该类酶拥有较高的序列似性，其三维结构呈对称的双叶型。按活性中心的不同，蛋白酶分为：丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

酸性蛋白酶在食品、酿造、毛皮与皮革、医药和饲料等行业中均有广泛应用。白酒酿造的发酵过程中，利用酸性蛋白酶起协同作用，溶解发酵原料的颗粒，提高原材料的利用率，促进微生物生长，分解蛋白质提供生香前体物质和风味物质，分解酵母菌体蛋白。在毛皮、皮革的制造过程中，酸性蛋白酶将纤维间质除去，使皮质更加柔软、丰满。饲料行业中，酸性蛋白酶的添加可提高蛋白质的可消化性，使高分子的蛋白质降解为低分子的肽及氨基酸，易于畜禽消化吸收，可降低饲料对幼仔消化道的刺激，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进畜禽生长。

现有技术中，野生酸性蛋白酶性能拙劣、产量低下，远远不能满足市场需求，因此，它很难被真正应用于工业化生产中。现在，常常采用构建基因工程菌的手段，强化酸性蛋白酶基因的转录和翻译，以提高酸性蛋白酶的产量。

目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH生长值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定。因此，酸性蛋白酶的酶活不高，酶自身最适作用条件与所催化的环境条件之间在pH、温度等方面的差别，导致酶的催化效率降低，从而限制了酸性蛋白酶在工业中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酸性蛋白酶高效表达的方法。

本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为N端连接有增强型α-信号肽的酸性蛋白酶；所述酸性蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述增强型α-信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述酸性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述增强型α-信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供表达所述融合蛋白的载体。

本发明的第三个目的是提供含有所述融合蛋白或载体的重组菌株。

在一种实施方式中，所述重组菌株以毕赤酵母Pichia.pastoris为宿主。

在一种实施方式中，所述重组菌株以pPIC9K为载体。

在一个实施方式中，所述宿主毕赤酵母是GS115、KM71和X33。