[发明专利]一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用

说明书

本发明公开了一种α‑愈创木烯合成酶、基因及应用。所述α‑愈创木烯合成酶来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明对蓝细菌来源的α‑愈创木烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α‑愈创木烯合成方法的发明与应用。发现蓝细菌α‑愈创木烯合成酶可在原核表达体系中催化FPP生成大量的α‑愈创木烯、以及少量的β‑榄香烯和α‑布藜烯，根据峰面积计算α‑愈创木烯的含量达到了79.5％，是目前报道的最大的产物比，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α‑愈创木烯的合成，进一步可应用于莎草奥酮的合成，具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用。

背景技术

α-愈创木烯(α-Guaiene)，CAS号：3691-12-1；分子式：C15H24；分子量：204.35100，结构式如式Ⅰ所示，可通过空气氧化，活性氧或者酶催化其C3位氧化生成莎草奥酮，后者具有强烈的辛辣胡椒籽香气和木香气味，在某些葡萄酒中能检测到。由于其在水中的香气检测阈值为8ng/L，是迄今为止发现的所有天然产物中最低的，具有巨大的应用前景。

但是，目前莎草奥酮未在香料和香精工业中应用，可能是由于目前没有有效的生产途径。

采用酶催化方法进行α-愈创木烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。

目前，关于α-愈创木烯合成酶的研究较少，如从葡萄Vitis vinifera中克隆的α-愈创木烯合成酶的催化产物有α-愈创木烯(占44％)和α-丁烯(35％)；而狼毒Stellerachamaejasme来源的α-愈创木烯合成酶TPS1能催化FPP(法尼基焦磷酸)生成少量的α-愈创木烯以及大量的guai-1(10)-en-12-ol，因此，这些报道的α-愈创木烯合成酶产物专一性不高。

分离并鉴定优质的α-愈创木烯合成酶基因，有助于α-愈创木烯的生物合成，同时也能进一步利用代谢工程或者生物合成相关技术进行α-愈创木烯以及莎草奥酮的细胞工厂生产，本发明具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，经研究发现了一种α-愈创木烯合成酶。

一种α-愈创木烯合成酶，来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

本发明又提供了所述α-愈创木烯合成酶在制备α-愈创木烯中的应用。

本发明又提供了编码所述α-愈创木烯合成酶的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，使用pET28a载体作为骨架。

本发明又提供了一种包含所述重组表达载体的基因工程菌。优选的，所述的基因工程菌，使用的宿主细胞为大肠杆菌。比如，常用的大肠杆菌表达菌株E.Coil BL21 codonplus。

本发明还提供了一种制备α-愈创木烯的方法，使用所述α-愈创木烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-愈创木烯。

优选的，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/mL，底物浓度为2μg/mL，二硫苏糖醇和MgCl₂的浓度分别为1mM和10mM，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。

反应pH可以是7.0，反应温度可以是在37℃。

本发明具有以下有益效果：