[发明专利]一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用

说明书

本发明提供了一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用。具体地，本发明提供了一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：(a)向导DNA(gDNA)；(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。并且，本发明还提供了基于本发明的可编程核酸内切酶Ago的一种富集和检测低丰度目标核酸的体系和方法。本发明所提供的检测体系和方法能够特异性地针对低丰度的核酸进行有效富集和高效检测，并且本发明的可编程核酸内切酶Ago具有强大的基因操作潜力。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白最早在一项描述拟南芥的突变体的研究中被提及。Ago蛋白是真核RNA干扰(RNAi)途径的关键参与者，可以在转录后调节基因表达，从而防御宿主入侵的RNA病毒并保护基因组完整性。目前已报道的Ago蛋白主要分为真核Ago(eAgo)和原核Ago(pAgo)两类。

原核Ago可以结合单链的guide DNA或RNA，催化与guide互补配对的靶标DNA或RNA的剪切。与CRISPR/Cas系统不同，原核Ago在对靶标核酸链进行剪切时，不需要PAM序列，它可以结合与靶标核酸互补的guide(DNA或RNA)，在靶标的任意位置进行剪切。

来源于古菌的高温Ago蛋白可在70℃以上发挥剪切活性，目前已表征的高温Ago一般可以在高温条件下，结合单链guide DNA或RNA，剪切靶标单链DNA,少数也可以剪切靶标单链RNA。

Ago蛋白近些年来也被应用于基因检测领域，由于其具有对野生型基因和突变型基因选择性剪切的性质，因此可以用于肿瘤相关基因中低丰度突变DNA的富集，如已经报道过的TtAgo和PfAgo。其中，利用新型核酸切割工具酶PfAgo，并偶联PCR反应实现边切割-边扩增的过程，而建立的“A-STAR(Ago-mediated Specific Target detection)”技术，便是一种具有高特异性并且可以结合多终端检测技术的富集技术。由于目前临床上针对稀有突变检测方法的局限性，新型检测技术及新型核酸工具酶的研究越来越成为研究热点。

然而，目前一些利用核酸工具酶的检测方法中，仍具有检测成本较高、步骤繁琐的不足。

因此，本领域迫切需要开发一种更加高效的低丰度DNA富集和检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种更加高效的低丰度DNA富集和检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸切割体系，所述核酸切割体系包括：

(a)向导DNA(gDNA)；

(b)可编程核酸内切酶Argonaute(Ago)；和

(c)任选的报告核酸，其中若所述报告核酸被剪切，所述的剪切是可以被检测出的。

在另一优选例中，所述核酸切割体系的温度为80-99.9℃，较佳地为90-99.9℃，更佳地为94-96℃，更佳地为95℃。