[发明专利]一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用，将嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因导入宿主大肠杆菌中进行串联表达获得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，并将该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌应用于核苷类似物的中试及规模化的绿色转化，采用本发明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制备阿糖核苷类药物，底物广谱，底物转化率高，产物易于纯化，反应条件温和，产物成分较为单一，副产物较少。

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌及应用。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，简称PNPase）广泛存在于真核生物和原核生物中，是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，能够可逆地催化嘌呤核苷（或脱氧核苷）发生磷酸化反应生成核糖（或脱氧核糖）-1-磷酸和对应的嘌呤碱基。细菌的PNPase作用底物广泛，己被用于合成阿糖腺苷，利巴韦林，5-甲基尿苷等一系列核苷类物质。

尿苷磷酸化酶（UPase）属于嘧啶磷酸化酶，能够可逆性地催化尿苷形成尿嘧啶。已被用于合成2´-氟尿苷，脱氧氟尿苷等，脱氧氟尿苷是一种良好的抗代谢类抗肿瘤药物，在肿瘤细胞内受肿瘤组织中嘧啶核苷磷酸化酶的作用而转化为真正起作用的5-氟尿嘧啶。

嘌呤核苷磷酸化酶单独作用时可合成腺苷、三氮唑核苷及其类似物；尿苷磷酸化酶单独作用时可以合成尿苷及其类似物，其中5-氟尿苷是重要的抗肿瘤药物。当嘌呤核苷与嘧啶核苷之间相互转化时，需要PNPase和UPase共同参与反应，可合成腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷及其类似物等核苷类化合物，实现多种核苷类似物的定向酶促转化。例如以阿糖尿苷和腺嘌呤为底物合成阿糖腺苷，及以阿糖尿苷（ara-U）和2,6-二氨基嘌呤为底物合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷（ara-DA）。阿糖腺苷是一种天然抗病毒化合物，具有广谱的抗疱疹和嗜肝DNA病毒活性，同时还有抑制乙肝病毒复制的作用。

磷酸化酶在野生菌株中含量较少或活性较低，现有技术中完成嘧啶或嘌呤核苷转化的一种方法是通过构建单一酶的过表达菌株，并结合工程菌自身本底表达的另一种磷酸化酶完成，但受本底表达的低活性酶限制而无法工程化应用；另一种方法是通过偶联两种工程菌株来完成，但涉及底物和中间代谢产物在菌株之间的传递，且需考察酶活性及菌种的比例协同，步骤繁琐，回收率低，成本较高。因此，该技术利用基因工程手段构建两种酶串联表达的工程菌株，利用两种酶的协同作用进行核苷类化合物的定向转化合成，突破单一酶催化的底物局限性和可逆性。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，并将该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌应用于核苷类似物的中试及规模化的绿色转化，采用本发明的嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶制备阿糖核苷类药物，底物广谱，底物转化率高，产物易于纯化，反应条件温和，产物成分较为单一，副产物较少。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，其特征在于：将嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶基因导入宿主大肠杆菌中进行串联表达获得嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌，该嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶串联表达工程菌为U-P-P(BL21(DE3)-pETDuet-1-deoD-udp) Escherichia coli U-P-P(pETDuet-1-deoD-udp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年9月10日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019706。

进一步限定，所述嘌呤/嘧啶核苷磷酸化酶编码基因源于大肠杆菌，其表达载体包括但不局限于pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1或pRSFDuet-1，所述大肠杆菌为以下任意一种：DH5α、BL21(DE3)或MG1655。