[发明专利]一种分离的CYP450蛋白及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种雷公藤细胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及该酶在合成松香烷型二萜类化合物中的应用。所述酶具有催化脱氢松香酸进一步氧化生成15‑羟基脱氢松香酸的生物学功能。本发明还涉及所述酶的编码基因、包含所述基因表达载体及工程菌，本发明推动了雷公藤甲素生物合成途径全解析，对雷公藤甲素等二萜化合物的合成调控具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及一种分离的蛋白，即雷公藤细胞色素p450氧化酶CYP81AM1，以及编码所述酶的多核苷酸，所述酶可用于二萜类化合物(松香烷型二萜类化合物，如催化15-羟基脱氢松香酸生物合成)的生物合成，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科雷公藤属多年生藤本植物，具有良好的杀虫活性，在抗炎、抗肿瘤和免疫抑制等方面广泛应用。萜类成分是雷公藤的主要活性成分，其中松香烷型二萜类化合物雷公藤甲素被公认为雷公藤中最主要活性成分之一，多个雷公藤甲素衍生物已进入临床研究阶段。从中药的活性成分中开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢且药用成分含量很低，大大限制了其应用。近年来利用合成生物学技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性产物已经成为一种极具潜力的获取方法。

萜类化合物在高等植物中的合成途径主要有两种，位于细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径和位于质体中的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径,通过以上两个途径生成萜类的共同前体异戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在异戊烯转移酶的催化下，3个IPP分子与1个DMAPP分子发生首尾相连，生成GGPP前体，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中间体母核结构(Su P.*,Gao L.H.*,LiuS.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygiumwilfordii [J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211-220)，然后母核在CYP450酶、转移酶等后修饰酶的作用下生成复杂多样的二萜类活性化合物。

细胞色素P450(cytochrome P450,简称P450)是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶。植物细胞色素P450具有广泛的催化活性，在植物体内催化多种初级和次级代谢反应，被人们称为“万能的生物催化剂”。在真核生物中，P450酶往往是通过N-端的疏水序列或者疏水环与线粒体内膜或内质网膜结合，因此很难分离纯化，其次由于P450蛋白质种类的多样性和底物催化的专一性，导致只有极少数的CYP450基因功能被鉴定。

苏平等人成功鉴定了雷公藤甲素生物合成途径首个CYP450基因(CYP728B70)，体外酶促研究证实其具备连续两步氧化雷公藤甲素二萜烯阿松香三烯形成脱氢松香酸的生物学功能 (TuL,SuP,et al.Genome of Tripterygium wilfordii and identificationof cytochrome P450 involved in triptolide biosynthesis.[J].NatureCommunications,2020.)。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种分离的蛋白，所述蛋白参与二萜类化合物的生物合成，尤其是松香烷型二萜类化合物，如15-羟基脱氢松香酸。

本发明中，所述分离的蛋白，是一种细胞色素p450氧化酶(或称为雷公藤细胞色素p450 氧化酶，以下可用CYP81AM1表示)，为一种参与雷公藤二萜类化合物的生物合成，尤其是雷公藤甲素生物合成的关键酶，所述酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO： 2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸其功能相同的肽。