[发明专利]一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用

权利要求书

1.一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：将蓝莓果实表面打孔，得到经打孔的蓝莓果实；

打孔的深度为4-5mm；

打孔的内径为1-2mm；

一枚蓝莓果实打孔的个数为3-10；

一枚蓝莓果实打孔的不同孔之间间距为5-15mm；

S2：将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液，得到蓝莓果实侵染悬液混合物；

所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；

所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；

所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；

所述农杆菌侵染液的组成成分为：8-12mM MgCl₂，150-250μM乙酰丁香酮，8-12mM 2-（N-吗啉）乙磺酸，水溶液，pH 5.0-6.0；

所述RNAi载体靶序列针对蓝莓ACO1基因；所述蓝莓ACO1基因编码的蛋白序列如SEQ IDNO.6所示；所述蓝莓ACO1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示；针对所述蓝莓ACO1基因的如SEQ ID NO.7所示靶序列进行RNAi操作；

将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌；

将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌；

采用Gateway克隆方法，将所述RNAi载体靶序列重组到所述T-DNA给体载体；

所述含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105；

所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV35S启动子；

所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的终止子为NOS终止子；

所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1300或双元表达载体Gateway™ 277载体；

在步骤S2中，农杆菌侵染悬液的制备步骤为：

将所述重组农杆菌的培养物离心，去除上清，得到第一沉淀；

用所述农杆菌侵染液清洗第一沉淀，离心，去除上清，得到第二沉淀；

将所述第二沉淀用所述农杆菌侵染液重悬，得到所述农杆菌侵染悬液；

每次离心的条件为：4000-8000rpm下离心3-10min；

所述农杆菌侵染液经活化后使用，活化的步骤为：用LB液体培养基培养所述重组农杆菌至菌液OD₆₀₀=0.5-1.0；

S3：将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境，得到经真空处理的蓝莓果实，所述真空环境的压强为0.016-0.08MPa，处理时间为5-10min；

所述清洗的溶液的组分为：8-12mM MgCl₂，150-250μM乙酰丁香酮，8-12mM 2-（N-吗啉）乙磺酸，pH 5.0-6.0；

S4：将经真空处理的蓝莓果实放在黑暗环境中培养，培养温度为20-28℃；培养时间为1-10天；培养的湿度为65-80%；

所述湿度是在如下组分的溶液环境中保持的：8-12mM MgCl₂，150-250μM乙酰丁香酮，8-12mM 2-（N-吗啉）乙磺酸，pH 5.0-6.0；

所述RNAi表达盒为瞬时基因表达；

所述蓝莓果实选自大绿期的蓝莓果实。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，使用无菌针状物或无菌杆状物进行所述打孔。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后使用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有抗生素的LB液体培养基。