[发明专利]一种中山杉体细胞胚胎发生的方法

说明书

本发明公开了一种中山杉体细胞胚胎发生的方法，属于林木细胞工程技术领域。该方法通过采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，分离出未成熟合子胚，诱导培养出含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织，并将获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织，然后转移到体细胞胚胎诱导培养基至诱导出中山杉体细胞胚胎。本发明利用中山杉未成熟合子胚诱导胚性愈伤组织，诱导率高，可短时间内获得大量胚性愈伤组织，并诱导出体细胞胚胎，是一种周期短、效率高生产中山杉苗木的技术，能够缓解苗木需求紧张，实现大量繁殖优质种苗的目标，在国内尚属首次。

技术领域

本发明属于林木细胞工程技术领域，具体涉及一种中山杉体细胞胚胎发生的方法。

背景技术

落羽杉属(Taxodium Rich.)属于杉科(Taxodiaceae)，属内主要分3个种，落羽杉(Taxodium distichum(Linn.)Rich.)、池杉(T.ascendens Brongn)和墨西哥落羽杉(T.mucronatum Tenore)。落羽杉属均为高大乔木，由于扎根深、根系庞大，扩基快，在欧美等国广泛用于湿地造林、防风固土和填充沟壑。中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)也称杂交落羽杉，主要是落羽杉，墨西哥落羽杉，池杉3个树种种间杂交得到的优良无性系的总称。中山杉兼具了落羽杉属树种间的主要优点：半常绿高大乔木，树干挺拔、树形优美、枝叶茂盛、树冠紧凑圆满、落叶期极短，生长快，抗风，耐盐碱，耐水淹，成材率好，观赏价值高等。目前在江苏、浙江、重庆、云南等十多个沿海、内陆省(市)累计造林示范面积超过1.9×10⁴ha，在我国未来用材林、能源林、碳汇林、休闲林和水源涵养林等营造以及沿海防护林建设、公路及城乡绿化、农田林网和滩涂造林等方面均有着巨大的应用潜力。

中山杉虽能自然结实，但出苗率极低，育种周期长，良种繁育目前主要采用传统的扦插繁育技术，但是受自然环境和季节性限制较大，长期持续生产非常困难。目前虽有中山杉关于不定芽增殖的报道，但增殖率低，生根困难，不足以短期满足苗木市场的巨大需求。

林木体细胞胚发生技术是目前林木繁殖效率最高，最具有应用前景的技术。林木体胚发生技术是在人工条件下通过诱导体细胞转向胚性细胞发育，获得胚性细胞，然后经过人工控制条件诱导形成体细胞胚，然后体细胞胚萌发进一步形成完整再生植株，原则上一个胚性细胞(团)发育成一株苗，具有无限性。在林木体胚发生技术中，胚性愈伤组织的诱导和胚性细胞维持和增殖是体胚发生体系的关键起始步骤。因此，首先建立一种高效、稳定的胚性愈伤组织的诱导、维持和增殖方法的十分必要。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种中山杉体细胞胚胎发生的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种中山杉体细胞胚胎发生的方法，包括以下步骤：

1)采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚；

2)在无菌条件下，将未成熟合子胚接种至诱导固体培养基中诱导培养获得含胚性胚柄细胞团的胚性愈伤组织；

3)在无菌条件下，将步骤2)获得的胚性愈伤组织转入维持和增殖固体培养基中，经继代培养，获得大量增殖的胚性愈伤组织；

4)在无菌条件下，将步骤3)获得的胚性愈伤组织转移到体细胞胚胎诱导培养基至诱导出中山杉体细胞胚胎。

进一步的，步骤1)中，8月中下旬至9月中旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子，经75％乙醇和2.5％次氯酸钠进行表面灭菌后，无菌条件下，分离出未成熟合子胚。

进一步的，步骤1)中，8月中下旬采集中山杉未成熟球果，取发育至早期子叶胚的种子。