[发明专利]氨氯地平作为质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用

说明书

本发明公开了一种氨氯地平作为质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用。化学探针为氨氯地平(Amlodipine,AML),与NO反应产物为脱氢氨氯地平(Dehydro Amlodipine,DAM)。建立了基于超高效液相串联质谱技术(UPLC‑MS/MS)的DAM定量分析方法。在体外NO的检测中，本化学探针AML与NO反应快速且呈线性，选择性好，灵敏度高，反应前后质谱响应变化明显。本发明中质谱探针方法的可行性由细胞实验验证，探针的细胞毒性低，可用于细胞中内外源性NO的检测研究，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用，尤其涉及一种氨氯地平作为质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用。

背景技术

一氧化氮(NO)作为一种可扩散转移的自由基分子，在血管张力调节、神经元信号传导、肿瘤发展进程和免疫应答中起着关键作用。多项研究表明，NO的许多功能是以浓度依赖性的方式激活的。定量监测生物系统中的NO，特别是在细胞中，将有助于了解其在健康和疾病中的确切作用。

基于NO的半衰期短(以秒为单位)，生物系统中浓度低(pM-μM)，扩散性强等特点，NO的检测具有相当的挑战性。众多研究者聚焦于荧光探针技术以实现NO的实时监测。然而，在荧光成像过程中，细胞自发荧光和其他反应产生的非特异性产物可能导致非特异性荧光信号，影响NO的定量分析的准确性。其他方法如比色法，所检测的对象一般为NO的氧化产物(NO₃^-,NO₂^-)，选择性低，难以准确测定体系中NO含量。

质谱(MS)或液质联用(LC-MS)技术是一种测量离子质荷比的分析方法。它能在液相分离的基础上，多通道连续检测多种物质。近年来，MS方法在检测活性氧和活性氮(ROS/RNS)领域获得了越来越多的关注。MS方法能够鉴定并定量检测ROS/RNS反应特异性产物，且灵敏度高。此外，MS方法在定量，重复评估和多个样品比较等方面功能强大。

综上所述，为了使检测NO水平更为精确可靠，开发特异性的质谱探针方法十分重要。

发明内容

发明目的：本发明的目的为提供一种在体外NO的检测中，与NO反应速度快，选择性强，质谱响应强度变化明显的氨氯地平作为质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用。

技术方案：本发明的如式I所示氨氯地平作为质谱探针在检测一氧化氮浓度中的应用：

进一步地，检测氨氯地平与一氧化氮的反应产物为脱氢氨氯地平，如式Ⅱ所示的化合物：

采用质谱技术检测产物脱氢氨氯地平。质谱技术为采用超高效液相色谱质谱联用和超高效液相色谱串联质谱方法。

所述脱氢氨氯地平的制备方法包括如下步骤：以化学探针氨氯地平为原料，投入NO饱和水溶液，室温避光，反应溶液经蒸干，液相半制备柱分离纯化，得到产物脱氢氨氯地平。

利用高效液相串联质谱检测脱氢氨氯地平，包含以下步骤：

(1)将脱氢氨氯地平配制成标准曲线和质控样品；精密称量纯化的脱氢氨氯地平，用乙腈稀释配制成8-10个浓度梯度的标准曲线和3个浓度水平的质控样品工作溶液；将脱氢氨氯地平标准曲线工作溶液比例与基质混合，涡旋仪涡旋配制得到基质标准曲线样品；将脱氢氨氯地平质控样品工作溶液按比例添加到基质中，涡旋仪混匀得到基质质控样品。

(2)内标为如式Ⅲ所示的尼莫地平工作溶液配制；

精密称量尼莫地平标准物质，稀释配制成单一浓度的内标工作溶液。