[发明专利]一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物化工领域。具体涉及一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。所述硝呋索尔半抗原结构如式(I)所示，其和载体蛋白偶联后得到所述人工抗原，以所述人工抗原作为免疫原制备得到相应的杂交瘤细胞3H10，所述杂交瘤细胞3H10分泌的单克隆抗体可以用于硝呋索尔的检测。本发明提供的硝呋索尔半抗原制备得到的人工抗原免疫小鼠制备得到的单克隆抗体在检测硝呋索尔及其衍生物时具有较高的灵敏度，为建立快速、简便、价廉、灵敏和特异的硝呋索尔检测方法提供了新的物质基础。

技术领域

本发明涉及生物化工领域。具体涉及一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术

硝呋索尔(Nifursol)，又称硝呋柳肼，是一种硝基呋喃类抗菌药物，作为饲料添加剂被广泛用于治疗猪、家禽和水产动物胃肠道感染(由大肠杆菌和沙门氏菌引起)，是预防火鸡组织球虫病(黑头病)的最后一道防线。硝呋索尔的结构和性质与其它硝基呋喃类药物相似，原药在体内代谢迅速，但其有毒代谢物却与蛋白质结合稳定，能在生物组织中存留较长时间。硝呋索尔原药在动物体内的主要代谢产物为3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-dinitrosalicylic acid hydrazide，DNSH)和5-硝基2-糠酸，二者均可作为硝呋索尔的残留标志物。

为了对硝呋索尔进行残留监控，需要建立快速、准确和可靠的分析方法，并要求高灵敏度(在RPA水平甚至更低)。目前，硝呋索尔及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等仪器方法，酶联免疫吸附(ELISA)、免疫层析等免疫分析方法也有少量报道。仪器分析方法虽然灵敏度高、重现性好，但耗时费力、检测成本昂贵并不适合大量样本的高通量检测。而基于抗原抗体特异性反应的免疫分析方法灵敏、快速、成本低且操作简便，非常适合现场检测。因此，设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于检测硝呋索尔代谢物的单克隆抗体显得尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。通过该硝呋索尔半抗原制备得到的人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的针对硝呋索尔及其衍生物的特异性抗体。

第一方面，本发明提供硝呋索尔半抗原，其结构如式(I)所示：

其中，R为

第二方面，本发明提供所述硝呋索尔半抗原的制备方法。具体地，针对式(II)所示化合物，其制备方法如下：

(1)3，5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3，5-二硝基水杨酸甲酯；

(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；

(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯；

(4)将3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯和NaOH在30～35℃反应2～3h后调节pH至酸性得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸；

(5)3-醛基-4硝基苯氧丁酸和3,5-二硝基水杨酰肼反应得到所述硝呋索尔半抗原；

针对如式(III)所示化合物，其制备方法如下：

(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；

(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；

(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、2-溴乙酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧乙酸乙酯；