[发明专利]针对小鼠ANXA2基因的siRNA的靶序列核酸及应用

说明书

本发明提供一种针对小鼠ANXA2基因的siRNA的靶序列核酸及应用，所述靶序列核酸的序列是：5’‑GGAAATGTACAAGACTGAT‑3’。本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA其cDNA序列的GC含量为36.8％，靶向对应NM_007585ANXA2基因，构建靶向小鼠ANXA2基因的siRNA慢病毒载体，将该载体包装成慢病毒侵染靶细胞小鼠足细胞MPC5，可采用该siRNA序列用于研究小鼠足细胞ANXA2基因功能及ANXA2基因对足细胞功能的调控作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对小鼠ANXA2基因的siRNA的靶序列核酸及应用，是针对一种小鼠肾小球足细胞ANXA2基因的siRNA靶序列的设计、构建、筛选及其在小鼠足细胞功能的调控中的应用。

技术背景

原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)即一类因为肾小球滤过膜通透性增加，使得血浆蛋白滤出增多，引起大量蛋白尿，并由此引发一系列特征性的病理变化的临床综合症。这类病人临床上常常表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症等特征。因国籍和种族的不同，PNS的年发病率在1.15～16.9/10,0000。微小病变性肾病综合征(minimal change nephrotic syndrome,MCNS)是其中最为常见的病理类型，这类病人中的绝大多数激素治疗有效，但是仍有10％～20％左右的患儿对糖皮质激素耐药，被称为激素耐药型肾病综合征(steroid resistant nephrotic syndrome,SRNS)，且SRNS患儿在诊断后的5年进展为终末期肾病的概率为8％～35％，在诊断后的15年进展为终末期肾病的概率为24％～66％。该病发病机制尚不完全清楚。

肾小球滤过屏障的基本结构是内皮细胞、基底膜和肾小囊脏层上皮细胞即足细胞。自1998年以来，人们逐渐认识到，足细胞结构、功能和/或数量异常是各类肾小球疾病患者发生蛋白尿的重要原因。足细胞相关分子的表达和功能异常是足细胞结构、功能和/或数量异常的分子基础。尽管如今我们对足细胞，肾小球滤过膜以及蛋白尿三者之间的关系已经有了更为深入的认识，然而仍有大量的根本性的问题亟待明确。例如，现有的研究已经充分证明足细胞胞体及其包括足突和裂孔隔膜在内辅助结构是阻挡血浆蛋白超滤的主要屏障。然而我们知道从解剖位置来看，足细胞并不直接承受来自血浆和血浆蛋白的压力，那么它是如何精确的发挥作用的呢？除了发挥物理屏障功能之外，足细胞是否也有一定的免疫功能？当面临各类免疫性或非免疫性损伤时，足细胞是如何进行应答的？足细胞内复杂的骨架蛋白网络是维持足细胞形态和功能的关键所在，它们是如何进行精准调控的？现有的研究已基本阐明，足细胞是以F-actin为基础，与MYH9、INF2、α-actinin-4、synaptopodin及Myo1e等细胞骨架相关蛋白一起构成足细胞骨架雏形的。尽管如此，目前已知的也仅是冰山一角，在我们的面前还存在很大的盲区和空白亟待研究。通过前期的临床研究，我们首次在部分原发性肾病综合征患者的体内检测到了一种Annexin A₂自身抗体。全国多中心的临床研究证实该自身抗体不仅与疾病转归相关，而且能用于预测激素治疗的敏感性，AnnexinA₂自身抗体阳性的患者发生激素耐药的概率要显著高于Annexin A₂自身抗体阴性的患者。进一步的动物实验证实，静脉注射抗Annexin A₂抗体可引起小鼠出现大量蛋白尿、肾小球局部足突融合和基底膜增厚；肾小球中nephrin、WT-1和ZO-1的表达下调，同时desmin的表达上调。研究表明nephrin、WT-1和ZO-1减少和desmin的上调均为足细胞损伤的标志物。体外细胞实验表明通过RNAi敲低Annexin A₂表达或采用抗Annexin A₂抗体对其进行阻断都可使足细胞的骨架蛋白受到影响，从而影响足细胞形态，损伤足细胞的功能。由此可见，Annexin A₂可能在维持足细胞形态和功能方面，防止蛋白尿的发生方面起着重要的作用。通过国内外的文献检索发现，对Annexin A₂功能的研究主要集中在肿瘤领域。Annexin A₂在多种肿瘤组织中高表达，抑制细胞内的Annexin A₂能抑制肿瘤细胞粘附、迁移和体内增殖。少数的研究发现，与正常妊娠组相比，先兆子痫患者Annexin A₂水平明显降低，血清Annexin A₂水平可能是先兆子痫的有用生物标志物，且这些先兆子痫患者中有很大一部分也伴有蛋白尿。目前Annexin A₂与肾脏及其他非肿瘤相关疾病的报道甚少。Yung等发现，系统性红斑狼疮患者血清中抗双链DNA抗体在肾脏的靶抗原就是Annexin A₂。Caster及Cheung等人报道，增殖性狼疮肾病人血清中Annexin A₂抗体有升高。Spijkers-Hagelstein等人发现，Src激酶诱导的Annexin A₂磷酸化介导了婴幼儿急性淋巴细胞白血病的糖皮质激素抵抗，是造成这些病人对治疗耐药、预后不良的主要机制，敲低ANXA2基因表达后可抑制Annexin A₂蛋白磷酸化，恢复急性淋巴细胞白血病病人对激素治疗的敏感性，而我们知道很多血液系统恶性肿瘤病人可并发肾病综合征，提示两者发病机制之间可能存在某些共性。然而，目前没有关于肾小球足细胞Annexin A₂缺陷引起蛋白尿进而导致原发性肾病综合征的报道。RNA干扰技术是进行基因敲低的主流技术，具有广泛的应用前景。