[发明专利]嵌合抗原受体(CAR)修饰的γδT细胞的制备方法、产品、抗肿瘤药物及其应用

说明书

本发明公开了重组CAR基因、相关生物材料、构建方法及其应用。该重组CAR基因依次包含U6启动子、靶向β2M的shRNA的编码基因、CAR基因。包含该重组CAR基因的CAR‑T细胞表达靶向于人β‑2M基因的shRNA，使HLA‑A，B，C在CAR‑T细胞表面的表达水平降低，能有效减弱宿主免疫系统对CAR‑T细胞的免疫排异，从而延长CAR‑T细胞在宿主体内的存活时间。

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域。具体地，本发明涉及基因修饰的过继性免疫细胞的制备方法、产品、抗肿瘤药物及其应用。

背景技术

过继细胞治疗(ACT)领域发展迅速，针对多种疾病的新疗法不断创新，其里程碑包括对表达工程嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、骨髓浸润淋巴细胞和体外扩增的NK细胞的治疗。

γδT细胞占成人外周血T淋巴细胞的5％左右，是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁。γδT细胞在人脐带血(CB)中较少出现，仅占CB T淋巴细胞的1％左右。γδT细胞作为身体的第一道防线之一，它们具有靶向和破坏癌细胞和感染细胞的固有能力。通过感应癌细胞特异性表达的应激信号，γδT细胞可以将癌细胞与健康细胞区分开，从而避免了脱靶毒性。恶性细胞株可以特异性地过度产生一种称为磷酸化抗原的小分子，而γδT细胞可以感应到这种过度生产，而被激活并杀死癌细胞。除了直接杀死癌细胞和感染的细胞外，γδT细胞也可以产生化学介质，以提高局部或全身免疫细胞的功能。

与此同时，γδT细胞作为免疫治疗的价值已经在研究中得到了证实，对来自39种不同恶性肿瘤的18,000个个体肿瘤的基因表达进行的分析表明，γδT细胞浸润肿瘤相对于其他免疫细胞浸润肿瘤的患者，预后最好。此外，与常规的癌症疗法(如化疗、放疗)不同，迄今为止，尚没有与γδT细胞疗法相关的严重的不良反应，并且临床结果显示是有希望的。γδT细胞表面受体(γδT TCR)不受组织相容性复合物(MHC)限制，这意味着如果供体的γδT细胞转移到患者身上，患者的身体不会将γδT细胞识别为外来物并且不会引起移植物抗宿主病(GvHD)。这使它们成为同种异体疗法的理想选择——可以从健康的捐赠者中采集，扩展到非常高的数量，储存和冷冻，为制造多种产品提供易于获得的起始材料。

将CAR的靶向能力和γδTCR的选择性组合为CAR-γδT细胞，具有以下优点：a.细胞杀伤的效力是相加的，因此天然的γδT细胞杀伤能力显著增强；b.没有附带损伤或过度刺激并且通过使用天然T细胞信号传导途径，发生与细胞因子释放相关的严重副作用的可能性降低；c.如果保留健康细胞，那么与常规CAR-T相比，在实际CAR-T治疗之前和之后的治疗负担可以显著降低，例如，健康B细胞可以与CD19靶向的CAR-T共存；d.由于可以耐受在健康细胞上的表达，因此可以极大地扩展靶抗原的选择；e.由于先天性杀伤，抗原逃逸发生概率较低，并且可以通过与靶向单克隆抗体组合来对抗，以影响ADCC介导的靶细胞杀伤。

虽然γδT细胞具有的天然优势使其成为CAR-T优良的载体，但由于细胞含量低、体外大规模扩增技术难、转染率低等限制使其很难实现产业化。

发明内容

本发明提供了一种重组CAR基因，所述重组CAR基因依次包含U6启动子、靶向β2M的shRNA的编码基因、CAR基因。

可选地，靶向β2M的shRNA的编码基因序列如SEQ ID NO.1-8中任意一种所示。例如，靶向β2M的shRNA的编码基因序列如SEQ ID NO.9中第252-310位所示。

可选地，U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9中第1-249位所示。

可选地，所述CAR基因依次包含MND启动子、信号肽编码基因、抗原结合结构域、铰链区及跨膜区的编码基因、共刺激信号转导结构域的编码基因、初级信号传导结构域的编码基因、连接序列的编码基因、安全开关的编码基因、WPRE。