[发明专利]H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明属于生物技术及动物免疫学领域，涉及一种H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体的制备方法。所述方法包括：将H5N8亚型禽流感病毒的HA基因上的裂解位点删除后连接到真核表达载体上得到重组表达载体；将重组表达载体免疫鹅后，分离得到H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体。与传统全灭活疫苗相比，本发明制备的H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体既确保了试验的安全性，又能诱导机体同时产生细胞免疫和体液免疫，使机体可长期维持有效的抗体水平。该H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体具有制备流程简单、免疫效果持久性强、安全性高等优点，可为受H5N8亚型禽流感病毒侵害的禽类提供了长效的免疫保护。

技术领域

本发明属于生物技术及动物免疫学领域，涉及一种H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体的制备方法。

技术背景

A型流感病毒属于正黏病毒科，为单股负链RNA病毒。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可将流感病毒分为18个HA亚型(H1～H18)和11个NA亚型(N1～N11)。其中，H17N10和H18N11两种流感病毒是从蝙蝠体内分离到的，其余各亚型的流感病毒均可在禽体内分离到，而野生水禽也正是这些病毒的储存库^[1,2]。禽流感病毒(avian influenzavirus,AIV)属于A型流感病毒，一般呈球形或丝状，其基因组包含表面基因HA和NA，核糖核蛋白(RNP)基因PB2、PB1、PA，核蛋白基因NP，基质蛋白基因M以及非结构蛋白基因NS 8个RNA片段。其中，HA蛋白能够与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，并协助病毒包膜与宿主细胞膜融合，在病毒生命周期中起着重要的作用，并且HA蛋白具有免疫原性，能够对机体形成免疫保护。自2010年首次在中国野鸭中分离出H5N8高致病性禽流感病毒(HPAIV)以来，其在亚太地区持续存在并暴发流行，导致大量禽类死亡，对众多国家的养禽业造成了重大损失^[3,4]。因此，监测H5N8亚型AIV不仅有利于养禽业的健康发展，而且对公共卫生安全具有重要的意义。

当前，防治禽流感的方法主要有监测、捕杀、无害化处理以及疫苗免疫等^[5]。全病毒灭活疫苗在疫苗接种中应用普遍，但这种接种方式会导致难以区分免疫鸡与自然感染鸡，干扰血清学的流行病学监测。因此，DNA疫苗凭借其安全性高、制备方法简单、易于储藏和运输等特点受到了广泛关注。

发明内容

为了解决上述至少一种现有技术问题，本研究以当前国内流行的H5N8亚型高致病性禽流感病毒作为代表毒株，将其HA序列的裂解位点删除后连接到真核表达载体pCAGGs上，以重组表达质粒免疫鹅，进而制备多克隆抗体，制备成功后收集血清抗体并注射到感染H5N8亚型高致病性禽流感病毒的禽类身上，从而达到治疗目的。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体的制备方法，包括：

将H5N8禽流感病毒的HA基因上的裂解位点删除后连接到真核表达载体上得到重组表达载体；将重组表达载体免疫鹅后，分离得到H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体。

优选的，用限制性内切酶分别对HA基因、质粒进行双酶切处理，然后用连接酶将质粒和HA基因连接后过夜转化到感受态细胞中进行扩增后再次酶切测序，将测序结果正确的质粒再进行扩大培养。

在本发明的一些具体实施例中，用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对HA基因、质粒pCAGGs进行双酶切处理，用T4连接酶将质粒和HA基因过夜连接后转化到感受态细胞中，菌液鉴定后，挑取阳性菌落、扩大培养并提取质粒，再次用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切获得目的基因并测序；将测序结果正确的阳性质粒转化至感受态细胞扩大培养，大量制备重组表达载体。

优选的，对鹅的腿部注射所述重组表达载体，对肌肉注射区域进行电刺激，免疫后对心脏采血，收集血清并制备得到H5N8亚型禽流感病毒HA多克隆抗体。