[发明专利]鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。所述特异性引物对为Fe和Re，Fe的序列如SEQ ID NO.1所示，Re的序列如SEQ ID NO.2所示。所述检测试剂盒包括特异性引物对、RPA核酸扩增试剂、量子点荧光微球与地高辛抗体的偶联物QDNBs‑McAb、核酸检测试纸条、上样缓冲液。特异性引物对的5’端分别修饰有地高辛和生物素，经过RPA核酸扩增后，阳性产物带有地高辛和生物素标记。本发明成功设计筛选了适用于RPA的特异性引物对，建立了能够鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测方法，其最低检测限为9.6×10³CFU/mL。所建立的方法无需使用大型仪器，适合于现场检测，并且该方法从基因组提取到肉眼观察结果的过程仅需要10min左右。

技术领域

本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。

背景技术

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌是耶尔森氏菌病的主要病原菌，它在自然界中分布广泛，不仅存在于土壤和河水、湖水等自然环境中，还存在于肉制品、乳制品等食物中。小肠结肠炎耶尔森氏菌是为数不多能在冷藏温度下存活并生长的细菌，因此可通过冰箱内的冷藏食品感染人类。近年来，耶尔森氏菌病在全球广泛流行，其中欧洲最为严重，我国在20世纪80年代也遭受过2次由耶尔森氏菌病引起的大流行。人和动物在被感染后会表现出若干病症，轻者表现为呼吸困难、胃肠炎、心血管疾病，重者可以引起败血症，甚至危及生命。由此可见，致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌所引发的疾病严重危害着人类与动物的健康，其产生的影响不容忽视。

小肠结肠炎耶尔森氏菌含有5种主要毒力基因ail、ystA、ystB、yadA和virF，其中，ail作为黏附侵袭位点基因，只存在于致病菌株中，并且经常被用于鉴定该菌的致病性。鉴于其对人体健康的巨大危害，我国要求按照SN/T 0174-2011方法对出口食品中的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌进行严格检测，但该方法需要很长时间去培养细菌。中国食品安全国家标准GB 4789.8-2016中规定的食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定方法有冷富集、培养基培养、尿素酶试验、半固体动力试验、革兰氏染色镜检和生化鉴定。这种方法通常与聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增(LAMP)等核酸扩增方法结合使用，这种结合虽然能够提高检测的灵敏度，但是该方法耗时略长，而且对大型循环加热仪器的使用(如PCR仪)是不可避免的。

自2006年，Piepenburg等开发重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)技术以来，该技术已广泛应用于病原的检测。RPA在恒温条件下即可对靶基因进行扩增，操作简单、反应快速，对仪器设备要求很低，在37℃～42℃某一适当温度范围内维持酶的活性即可完成核酸扩增。核酸扩增结果的判定主要是利用仪器法或肉眼观察法。琼脂糖凝胶电泳法与荧光检测仪法均需要借助仪器来判定结果，荧光染料法虽然只需肉眼观察颜色的变化，但染料具有很强的非特异性，能够与任何双链DNA结合而显色从而影响判读。

发明内容

本发明的目的是，提供一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对、检测试剂盒及其应用。旨在解决现有技术中检测方法需要使用加热仪器、检测时间较长，检测灵敏度相对不高的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种鉴定致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性引物对，所述特异性引物对为Fe和Re，Fe的序列如SEQ ID NO.1所示，Re的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供所述的特异性引物对在非诊断或治疗目的检测致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌中的应用。

本发明还提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物对。