[发明专利]一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种具有高活力和高转化率蔗糖异构酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。该突变体包括突变体Y246L、H287R、H481P，属于基因工程技术领域。本发明通过设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码突变体的基因，并在大肠杆菌表达系统中进行表达，得到的蔗糖异构酶突变体活力和转化率显著提高。本发明制备的蔗糖异构酶突变体是一种更高效的生物催化剂，在异麦芽酮糖的工业生产中应用可以提高生产效率，减少生产成本。

技术领域

本发明涉及一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

异麦芽酮糖(isomaltulose)又称帕拉金糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，是一种功能性二糖，属蔗糖同分异构体，为还原性糖，可被加氢还原。异麦芽酮糖晶体呈正交晶体，含水时异麦芽酮糖晶体的相对分子质量变为360.32，熔点为120-128℃，25℃时水溶性为250g/L；与蔗糖相比甜度自然且甜度为其52％，因而可作为新型甜味剂替代蔗糖。

美国FDA批准异麦芽酮糖作为安全型食品添加剂，无摄入量限制。其所具有的理化性质和生理功能也使得异麦芽酮糖能够替代蔗糖广泛的应用于功能饮料，减肥保健品，糖尿病人食品中等。我国糖尿病患者，肥胖综合症患者数以千万计，因而成为异麦芽酮糖工业化生产的市场保证。目前，全球已有40多个国家和地区已开始使用异麦芽酮糖来替代蔗糖作为食品添加剂，其中欧美与日本使用最多，2009年消耗量就已经达到100000t。而就我国而言，异麦芽酮糖需求量大，而国内异麦芽酮糖的工业化生产起步晚产能低，因而所需产品主要依赖德国和日本的进口，其中该糖的市场售价为1.5万元/t。

异麦芽酮糖在自然界极少，只少量的存在于蜂蜜和甘蔗汁中，因而直接的提取方法不可用。目前，经文献报道的异麦芽酮糖合成方法主要有：化学合成法、植物体内转化法、微生物细胞转化法、蔗糖异构酶转化法。化学合成法成本高且污染大，植物体内转化法会导致植物生产停滞，而微生物细胞转化法由于发酵液成分复杂，导致后期分离纯化困难。故目前生产异麦芽酮糖的最佳方式为蔗糖异构酶转化法。

蔗糖异构酶，又称α-葡糖基转移酶，能够将蔗糖转化成异麦芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量单糖的一种酶。蔗糖异构酶的催化机理：亲核攻击作用蔗糖使α1-β1糖苷键断裂及果糖基的取向；异构化或水解的发生。蔗糖异构化过程即蔗糖异构酶催化蔗糖转化的两种去向如图4所示。

用蔗糖异构酶来实现异麦芽酮糖的高产率，高纯度，低成本的生产始终是蔗糖异构酶研究的方向。在用蔗糖异构酶生产异麦芽酮糖的过程中，酶的利用率低和不可避免生成的副产物是两个重要的不利因素，且因为这两个因素使得异麦芽酮糖的生产成本维持在较高水平，而高成本也限制了异麦芽酮糖替代蔗糖的步伐。与单糖副产物的产生相比，在使用蔗糖异构酶的过程中，产生蔗糖的另一种同分异构体——海藻酮糖，由于其和异麦芽酮糖结构的相似性，使得下游分离纯化的难度提高，一般工业上分离海藻酮糖与异麦芽酮糖使用重结晶的方法。更高的异麦芽酮糖转化率意味着在生产过程中，可以使异麦芽酮糖的产率更高，或生产纯度更高的异麦芽酮糖产品。与此同时，提高蔗糖异构酶的酶活，可以提高生产效率，减少生产成本。

为了获得更高效的生物催化剂，筛选新的并且可能具有高效率生成异麦芽酮糖的蔗糖异构酶是当前的关键任务。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体、工程菌及应用，通过定点突变的办法，对筛选到的蔗糖异构酶进行分子改造，从而进一步提高其催化活性并得到更适合于工业应用的蔗糖异构酶。

技术方案：本发明采用的技术方案如下。

本发明的第一个目的是，提供一种具有高活力和高转化率的蔗糖异构酶突变体，该蔗糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8其中任意一种所示。