[发明专利]一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202110394158.1 | 申请日： | 2021-04-13 |
| 公开（公告）号： | CN112852655A | 公开（公告）日： | 2021-05-28 |
| 发明（设计）人： | 宋育阳;黄蓉;秦义;刘延琳 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/57;C12N15/81;C12N11/16;C12P21/06;C12P21/00;C12R1/865 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 薛红凡 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 细胞 表面 展示 酸性 蛋白酶 酿酒 酵母 工程 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将密码子优化后的酸性蛋白酶编码基因插入到酿酒酵母表面展示表达载体PUC-GAP-α-factor-SED1中，得到重组载体；
2)将所述重组载体转化转入宿主菌株酿酒酵母中，得到细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述密码子优化后的酸性蛋白酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶编码基因扩增用引物为pepA-F/pepA-R；
所述pepA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述pepA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述PUC-GAP-α-factor-SED1的构建方法，包括以下步骤：
A.以酿酒酵母的基因组为模板，采用GS linker-Sed1-F/Sed1-R引物对进行PCR扩增，得到Sed1-GS linker的DNA片段；
所述GS linker-Sed1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述Sed1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
B.用EcoRI和XbaⅠ酶对质粒pYES2/CT/α-Factor进行线性化处理，将所述Sed1-GSlinker的DNA片段和得到的线性化的pYES2/CT/α-Factor进行连接，得到连接产物为载体PUC-GAP-α-factor-SED1。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母表面展示表达载体的插入多克隆位点为SphI/ClaⅠ。
6.根据权利要求1、4和5任意一项所述构建方法，其特征在于，所述宿主菌株酿酒酵母的菌株包括酿酒酵母BY4741菌株。
7.权利要求1～6任意一项所述构建方法构建得到的细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌的细胞表面稳定表达酸性蛋白酶。
8.根据权利要求7所述酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌的酸性蛋白酶酶活为4.01～5.80U/mL。
9.权利要求7或8所述酿酒酵母工程菌在催化蛋白质水解中的应用。
10.一种用于催化蛋白质水解的全细胞催化剂，其特征在于，包括权利要求7或8所述酿酒酵母工程菌。
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