[发明专利]一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用

说明书

本发明公开了一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于微生物技术领域。本发明本发明提供了一种来源于Bacteroides nordii诺迪拟杆菌的肝素酶I BnHepI；来源于Bacteroides finetgoldii细沟拟杆菌的肝素酶I BfHepI，具有很好的热稳定性，其中，本发明中发现BnHepI的最适反应pH为8，最适反应温度为40℃；该酶具有较高的酶活，在最适条件下的最高酶活可达360.45IU/mg。同时，该肝素酶具有良好的热稳定性，50℃下的半衰期为10.6min，40℃下的半衰期为244min。表明该重组酶具有较大的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶I及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

肝素(Heprain)是一种特异性质多分散的混合硫酸化多糖，广泛分布于哺乳动物组织中，以共价键形式和蛋白质结合。目前商业肝素主要是从牛肺和猪小肠黏膜中提，结构复杂且具有多种重要的生物学功能，一般在临床上用于血栓，心血管等疾病的治疗。低分子量肝素(Low molecular heparin，LMWH)是肝素通过某些物理化学方法裂解而产生的一小段肝素，与蛋白质或细胞结合的能力有所下降，但抗凝活性显著增加。与正常肝素相比，低分子肝素可降低抗因子IIa的活性，极大程度地减小了出血的危险性。目前制备低分子肝素有物理、化学、生物和合成方法。其中，生物酶解法由于具备条件温和、选择性强、污染小等优点，现已成为一种新兴的方法。

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验。

从自然界中得到的不同的产肝素酶微生物，所产肝素酶也多种多样，用于酶解肝素得到的产物也各不相同，目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。随着对低分子肝素的研究不断深入。人们发现，低分子肝素除了具有抗凝活性外，还对肿瘤、炎症、产科妊娠等疾病具有广泛作用，针对低分子肝素的不同药理活性进行新药开发具有广阔的前景。

但肝素的结构高度复杂，具有某种药理作用的活性位点在整个混合物中较少，而且容易受其它近似结构干扰，由此对药物开发带来干扰。而肝素酶对肝素的酶切位点比较专一，由此可分离得到较大量结构相同的片段，有利于药物开发。

研究最多的是肝素酶I，但是目前肝素酶的热稳定性很差，导致其无法很好地适应工业化应用。这已经是阻碍酶法制备低分子肝素的瓶颈。因此，寻找热稳定性好的新型肝素酶，具有重要意义。

虽然，公开号为CN109666666B的中国发明专利当中公开了一种肝素酶I，但是其来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)，其原始酶的半衰期仅为6min，虽然该专利基于分子动力学的酶柔性分析提供了一种提高了肝素酶I热稳定性的突变体，但是突变酶的构建需要使用计算机进行分子动力学模拟和虚拟突变筛选，需要的门槛较高，难以实现广泛的推广。因此寻找挖掘热稳定性好的原始酶肝素酶I，仍然具有重要的意义。

发明内容

技术问题：