[发明专利]抗DOG1蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种可以识别人DOG1抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。技术方案选取DOG1蛋白C末端的53‑291位氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含DOG1蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗DOG1蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株19F2,以及由该细胞株所分泌的抗DOG1蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达DOG1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗DOG1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

DOG1(discovered on gastrointestinal stromal tumors protein 1)蛋白是一种新近发现的膜蛋白，DOG1,该蛋白的编码基因是TMEM家族的一员，包含有26个外显子，定位于11q13。该区域是人类癌症中扩增最频繁的区域之一，主要调控细胞周期、增值与调亡，周围有著名的癌基因，如FGF4、FGF9、CCND1、FADD、CTIN等。该蛋白主要定位于胞膜上，有八个跨膜结构，并且N端和C端均在胞质内，是一个钙离子激活的氯离子通道蛋白，推测其功能可能是一种转运蛋白。近年以来，许多研宄发现该蛋白主要在胃肠道间质瘤中选择性高表达，与传统的CD117相比，其对于诊断胃肠道间质瘤具有更高的敏感性与特异性。

很多研究同时也证明，在胃肠道间质瘤的前体细胞—卡哈儿细胞(Insterstialcell of cajal，ICC)上高表达。在人和小鼠的ICC细胞免疫荧光染色研究中发现，所有的CD117阳性的细胞上也同样存在的DOG1表达，但是在CD117阳性的肥大细胞上面没有DOG1的表达。进一步的研究发现，DOG1蛋白是细胞形成慢波，从而调节胃肠道基本电节律的基础。

目前绝大部分对于DOG1蛋白的研究是关注于其与胃肠道间质瘤的关系，而DOG1蛋白与其他肿瘤的关系目前研究较少。该蛋白的编码基因于2002年首次被报道在口腔癌中扩增，并被认为是一个潜在的癌基因。美国陆军病理研究所2009年报道了他们对1168例胃肠道间质瘤和672例其他肿瘤及正常组织的免疫组化染色结果，发现DOG1主要表达在胃肠道间质瘤(94.7％)、食管鳞癌(60％)、胃癌(26.2％)以及部分其他部位的平滑肌瘤，而在正常组织中几乎不表达。另外一篇类似的研究使用了2837例不同的肿瘤进行DOG1免疫组化染色，发现约100％的胃肠道间质瘤、10％的头颈部麟癌、13％的食管鳞癌和腺癌以及11％的膀胱腺癌为阳性结果。此外，其他的一些研究也证实DOG1蛋白在乳腺癌、胰腺癌中也有表达。

最近已有部分研宄开始探索DOG1在恶性肿瘤发生、发展中的机制。研究发现大约15％的乳腺癌中，11q13区域扩增，从而会导致DOG1蛋白高表达。此外，还发现DOG1基因扩增与蛋白高表达与乳腺癌患者疾病进展和预后不良有关。接着，在DOG1扩增的三株乳腺癌细胞系(ZR75-1、HCC1954、MDA-MB-415)、一株头颈部鳞癌细胞系(Tel1)以及一株食管鳞癌细胞系(FaDu)中将其敲降，发现细胞增殖变缓、调亡增加，而小鼠模型上移植瘤生长变慢。此外，还证实敲降或者利用药物阻滞可以抑制EGFR信号通路以及CAMKII信号通路。证实了DOG1在肿瘤增值中的意义以及作为候选治疗靶点的价值。

胰腺上皮细胞富含钙离子激活的氯离子通道，其对于调节上皮分泌、维持细胞容量、调节细胞调亡有重要意义，而DOG1就是一种钙离子激活的氯离子通道。研究发现DOG1基因及蛋白在人转移性胰腺癌细胞系扩增和高表达，在72例胰腺癌组织的免疫组化中染色发现，表达越高，分期越晚，评分越高。利用敲降后肿瘤细胞生存时间缩短、转移侵袭能力减弱。向小鼠移植瘤内直接注射可以抑制肿瘤生长。同样证明了DOG1是一种潜在癌基因。

发明内容

发明人提供了一种抗DOG1单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 20771的杂交瘤细胞株产生。