[发明专利]一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

(2)将靶向小鼠Pax2基因的sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒；所述sgRNA的5’Guide序列如SEQ IDNO.5所示，且所述sgRNA的3’Guide序列如SEQ ID NO.10所示；

(3)将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F₀代小鼠；

(4)筛选F₀代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F₁代小鼠；

(5)筛选所述F₁代小鼠中基因正确表达的杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠交配，得所述Pax2条件性基因敲除小鼠模型；

步骤(1)和(2)之间不存在时间上的先后关系。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中扩增所述LR、A和RR片段的PCR程序，均为：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。

3.权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述连接包括依次将LR片段连接至NotI和BamHI酶切位点之间，将A片段连接至SalI和BglII酶切位点之间，将RR片段连接至XhoI和EcoRI酶切位点之间。

4.权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(4)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对包括Pax2-L-GT-F和cKO-5'-DO-F；另一对包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R；

所述Pax2-L-GT-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述cKO-5'-DO-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

所述cKO-3'-DO-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述Pax2-R-GT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(5)所述筛选包括利用两对引物进行PCR，其中一对引物包括Pax2-L-GT-F2和cKO-5'-DO-F；另一对引物包括cKO-3'-DO-R和Pax2-R-GT-R1；所述Pax2-L-GT-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Pax2-R-GT-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

6.根据权利要求4或5所述构建方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)所述筛选时，PCR扩增的程序均包括：94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸1kb/min，每个循环退火温度降低0.7℃，共15个循环；98℃变性10s，57℃退火30s，68℃延伸1kb/min，25个循环；68℃延伸10min。

7.利用权利要求1或6任一项所述构建方法构建得到的Pax2条件性基因敲除小鼠模型在构建全身性基因敲除小鼠模型中的应用。