[发明专利]一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒。本发明基于牛结节性皮肤病病毒基因中的强保守区段作为靶基因，进行构建特异性引物对和探针，并对该探针进行荧光标记，有助于提高牛结节性皮肤病病毒的检测便捷性、灵敏度、特异性，同时缩短检测时间；另外，由该引物对和探针构建的牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，对牛结节性皮肤病病毒具有极高的检测特异性和灵敏度，其检测灵敏度达1×10^‑7ng/μL。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于分子检测领域，涉及一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒。

背景技术

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpyskin disease virus，LSDV)引起的一种病毒性传染病，又称为牛疙瘩皮肤病、牛结节性皮炎和牛结节疹。该病是世界动物卫生组织(OIE)须通报的动物疫病，也是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病。

LSDV属于双链DNA病毒，基因组大小约为151kbp，由一个具有相同2.4kbp反向末端重复序列的中央编码区域156个假定基因组成，编码宿主范围、毒力和免疫逃逸的基因位于基因的末端。利用现场样本和疫苗毒株的限制性核酸内切酶对其DNA进行分析，表明其与羊痘病毒毒株之间的同源性可达80％，且与山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)的基因组核苷酸具有96％的同源性，因此简单的血清学方法很难将其区分。

现场作出初步快速诊断确认，是成功控制和根除流行地区和非流行地区LSD的基础。目前，首选的诊断工具为分子检测方法，且正逐步取代传统的检测方法。荧光定量PCR检测方法可特异性检测LSDV，而与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒均无交叉反应，敏感性明显优于普通PCR，能够快速准确地检测LSDV，但是实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，因此难以得到全面推广。

酶促重组等温扩增((Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)技术是一种等温核酸扩增技术，它是利用抗体制药领域先进的Molecular Design、DirectedEvolution、Affinity Maturation等技术手段，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系，其反应体系类似于RPA，在40-42℃恒温条件下，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍。运用荧光ERA方法可快速鉴别LSDV，以便于及时采取相应的防控措施。

发明内容

为解决现有牛结节性皮肤病检测技术存在的耗时长、容易污染，对操作人员与操作环境要求高的问题，本发明提供一种快速检测牛结节性皮肤病引物对、探针及试剂盒，具有操作简单、耗时短，能够在现场快速检测，对于牛结节性皮肤病的高通量快速检测具有重要意义。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一组用于牛结节性皮肤病病毒快速检测的引物组，该引物组由一对特异性引物对和一条特异性探针组成，

其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的核苷酸序列为：5’-TCACAGAAGAACAAGTTGGAGATGATTCAC-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GAACAATCAAAAATTATGATTAATTCCATGTTG-3’；

特异性探针的核苷酸序列为：5’-AATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAAACGCACATGATTCCCTAATG-3’。