[发明专利]一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。包括采样用核酸吸附材料、阳性对照膜片、阴性对照膜片、样品采集管、漂洗管A(红盖)、漂洗管B(蓝盖)、扩增检测管、研磨棒、牙签、滤纸条、说明书。本发明试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为55分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360‑14L、CD2v三个基因。

技术领域：

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒及其应用。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。自2018年8月初我国发生ASF疫情，扑杀生猪超过100万头，给我国养猪业造成了无法估量的损失。目前，ASF缺乏有效疫苗防制，建立快速、灵敏、特异的诊断方法对ASF的防控至关重要。由于对ASFV检测更简单、更快速的需求，促进了快速检测试剂盒的飞速发展。2019年1月4日，中国动物疫病预防控制中心批准了11家快速检测试剂方法，其中荧光PCR类有8家公司，核酸等温扩增类(LAMP检测试剂盒)有1家公司，试纸条类(主要为抗原检测试纸条)有2家公司。

2019到2020年，大规模养殖企业逐步建立了ASFV的荧光PCR实验室快速监测体系。通过检测人员、车辆、物资和环境擦拭物等样本，阻断传染源；通过定期抽检和对异常猪加强巡查和监测，在早期阶段及时发现猪场内的ASFV感染；一旦发现阳性猪，荧光PCR检测快速确定猪群感染率，排查传染源和传播途径。这一套体系可有效控制ASFV野毒感染，将疫情的损失控制在一定范围。然而，ASFV的荧光PCR检测方法需要训练有素的操作人员，且依赖于成本昂贵的检测仪器，限制了其在小规模养殖企业或散户检测的应用。

阻碍当前检测方法广泛应用的另一瓶颈是从复杂的生物样品中(如，动物血液、组织、肛拭子等样本)现场快速提取核酸的要求。基于核酸恒温扩增技术(Nucleic acidisothermal amplification technology,NAIAT)的核酸检测方法能够实现快速、简单、高效的扩增，且对仪器依赖性低，非常适用于现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)中，是一种极具应用潜力的核酸分析手段。考虑到当前猪场ASF基因缺失弱毒株的检出率逐渐上升，ASF基因缺失弱毒株在猪场内潜伏感染传播，在感染初期非常难以察觉，一旦发现感染率已经非常高，难以实施拔牙处置，给猪场带来巨大的损失。仅通过常规的ASFV P72荧光定量PCR试剂盒难以在早期发现疫情、对野毒和基因缺失弱毒株进行鉴别诊断，以采取针对性的防控措施。所以急需一种可以在现场快速高灵敏鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是无论核酸提取还是荧光PCR检测都存在或是涉及需要外部电源的实验室设备(如荧光PCR检测仪和离心机)、几个小时的测定时间、和训练有素的技术人员，或是提取时间长、需要离心、多个移液转液步骤等问题，不能满足将集中式实验室测试转变为现场养殖环境中普遍存在的核酸检测微型化和实用化的需求。

为解决上述问题，本发明提供了一种应用于非洲猪瘟病毒现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，该试剂盒只需要一个保温设备(水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，或者由一个保温杯、一个温度计和薄泡沫板制成简易保温装置)，检测全过程(从核酸提取、扩增至结果判读)为45分钟，检测结果与中国动物疫病预防控制中心批准的荧光PCR类产品无显著差异，且本试剂盒还能同时检测p72、MGF_360-14L、CD2v三个基因。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种非洲猪瘟病毒现场鉴别诊断试剂盒，包括以下组分：