[发明专利]增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用

说明书

本发明属于基因启动子技术领域，公开了一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用，启动子P_EMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子的筛选方法包括：构建合成启动子调控报告基因表达的重组质粒；启动子活性的体外初步筛选；含报告基因的质粒的构建；启动子活性研究实验。本发明提供的增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子P_EMS，在体内、体外实验中的表达效率显著高于CMV启动子，在骨骼肌中启动基因表达的强度、特异性及持续时间方面表现优秀，在后续的基因治疗领域具有很大的潜能，可通过肌肉注射在实验动物乃至人体实现生物学功能或进行基因治疗。

技术领域

本发明属于基因启动子技术领域，尤其涉及一种增强型骨骼肌细胞高效特异性启动子、筛选方法及应用。

背景技术

目前，在基因治疗中，肌肉注射含目的基因的质粒是持续有效的方法。骨骼肌细胞具有细胞体积大、性能稳定、生命周期长等优点。骨骼肌分布范围广、数量多、体积大，可承受较大容量注射，且注射易操作；其血管丰富，使得细胞表达的功能性分泌蛋白更易进入血液循环系统以发挥治疗作用；重组治疗蛋白可在肌肉组织中持续表达较长时间。基于上述几点，以病人自身骨骼肌细胞来“生产”重组治疗蛋白的基因治疗策略具有很大应用前景。

外源基因进入骨骼肌细胞中表达主要通过病毒或非病毒载体两种方式。病毒载体基因传递效率高，但其制备较难、易引起机体的免疫和炎症反应，甚至能突变产生有活性的病毒颗粒，或引起恶性突变等，因此其临床应用具有较大风险和难度。相比之下，以质粒为代表的非病毒载体有着独特的优势，如低毒性、低免疫原性、低成本、易构建、可携带大片段外源基因等，故而以质粒为载体的基因治疗体系极具研究价值和应用潜力。但是，质粒表达体系在肌肉细胞中的基因表达效率较低是其进行有效基因治疗的重要制约因素，故提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要意义。

外源基因在肌肉组织中的表达强度受多方面因素的影响，主要包括转录调控元件、基因传递材料和基因传递方法等。同时，一些功能基因在异位组织的高表达可能产生安全隐患。因此，基因治疗体系必须兼顾有效性和安全性。外源质粒进入细胞后，所携带功能基因的表达主要受转录调控元件的影响，其中启动子是核心因素，调控着基因表达的强度和时间、空间特性，即，启动子的强度和特异性决定了基因表达的水平和组织特异性。因此，通过构建高效、组织特异性启动子来调控目的基因表达的强度和组织特异性，是一种快捷、高效的策略。

人巨细胞病毒启动子(CMV)是一种广泛应用的病毒启动子，其活性较强，但其表达外源基因几乎没有细胞特异性，基因表达的持续时间也不长。一些天然肌肉特异性启动子，如骨骼肌特异性启动子a-actin启动子、肌球蛋白轻链2(MLC2)启动子、肌球蛋白轻链3F启动子和肌酸激酶(MCK)启动子能在肌肉细胞中特异性激活，其中MLC2启动子的肌肉特异性最高，只能在心肌细胞中激活。但这些天然的肌肉特异性启动子表达外源基因的效率通常远低于CMV等病毒性启动子，因此也限制了其实际应用。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有外源基因进入骨骼肌细胞中表达的方式中，病毒载体基因制备较难、易引起机体的免疫和炎症反应，甚至能突变产生有活性的病毒颗粒，或引起恶性突变等，因此其临床应用具有较大风险和难度。

(2)现有外源基因进入骨骼肌细胞中表达的方式中，质粒表达体系在肌肉细胞中的基因表达效率较低是其进行有效基因治疗的重要制约因素。

(3)现有的天然肌肉特异性启动子表达外源基因的效率通常远低于CMV等病毒性启动子，因此也限制了其实际应用。