[发明专利]TGF-β3间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种TGF‑β3间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，所述TGF‑β3间充质干细胞外泌体是间充质干细胞分泌的外泌体，且在间充质干细胞膜上能表达TGF‑β3融合蛋白；所述TGF‑β3融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的TGF‑β3蛋白，连接肽和间充质干细胞跨膜区。本发明所获得的能高表达TGF‑β3在膜表面的间充质干细胞外泌体，其能够发挥促进表皮细胞的增殖和迁移的作用；TGF‑β3间充质干细胞外泌体除了能够保留间充质干细胞的促再生能力，并且增强了TGF‑β3稳定性，提高外泌体到达皮肤受损细胞的特异靶向性，还能抑制免疫细胞的活化增殖，缩短伤口愈合时间，减少瘢痕形成，对组织损伤具有良好的治疗效果。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及TGF-β3间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

疤痕和纤维化是外科和非外科皮肤损伤的最终结果，而疤痕和纤维化不仅会导致不良的皮肤外观还会损害皮肤的功能，有时还会引起不良的心理影响和疼痛，疤痕的形成与许多的因素相关，例如伤口的深度，大小，受伤的位置，个人的体质差异，年龄等等。例如烧伤，外伤和某些外科手术后皮肤伤口愈合失调留下严重的疤痕。有研究发现动物胚胎伤口中表现出高水平的TGF-β3和低水平的TGF-β1和TGF-β2表达(Dev Biol.1991Sep；147(1):207-15.doi:10.1016/s0012-1606(05)80018-1)。在临床实验中也证明TGF-β3能够改善皮肤的瘢痕形成(Lancet.2009Apr 11；373(9671):1264-74.doi:10.1016/S0140-6736(09)60322-6)。TGF-β3是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员之一，在组织修复过程中起着关键的调节作用，促进伤口边缘上皮细胞以及成纤维细胞的增殖和迁移，抑制免疫细胞的增殖和炎症因子的释放，与伤口的纤维化愈合有关，可以加速伤口闭合，避免炎症的迁延不愈，在改善瘢痕形成方面潜力巨大。但是由于生长因子的体内稳定性低，伤口周围皮肤的吸收受限，到达伤口区域之前的渗出作用消除以及其他不良副作用影响了TGF-β3的成药性。

间充质干细胞由于具有很强的分化能力，可以替换受损细胞，已经被很多文章报道了其具有良好的促进组织修复再生能力，但是也有文章指出由于其免疫调节能力强等特点能够引起过度的免疫反应以及其他的副作用。因此需要寻找可替代的无细胞疗法，降低细胞治疗的风险。间充质干细胞在组织修复中的作用主要是通过旁分泌因子进行的，其中外泌体作为其中的旁分泌介质发挥着重要的作用。外泌体是几乎所有细胞类型都会分泌的一种双层脂质纳米囊泡，通过将脂质，蛋白质和核酸传递给邻近细胞来进行细胞间的通信，其具有细胞、组织特异性和有效的免疫调节作用，而且具有很低的免疫原性和恶性潜能。而间充质干细胞来源的外泌体具有间充质干细胞的部分特性，包括免疫抑制，减少细胞凋亡，抑制炎症以及促进再生。因此采用间充质干细胞来源的外泌体治疗组织损伤被认为是可行的细胞疗法的替代方法。细胞疗法目前仍然存在移植成活率低，特异性分化率低，有免疫排斥和血栓以及癌变的风险，而外泌体作为一种脂质双层膜结构的囊泡，能够冻存在-80℃，方便储存应用，并且稳定性较强，因此在疾病治疗方面有很好的应用前景。

间充质干细胞分泌的外泌体能够携带很多内容物，包括TGF-β3，在外泌体递送到受体细胞后，能够将从间充质干细胞携带出来的内容物释放到受体细胞，实现细胞通讯功能，调节受体细胞的生理功能，影响细胞的增殖迁徙。但是由于TGF-β3主要是表达在间充质干细胞以及其分泌的外泌体的膜内，并且含量较少，存在着靶向性差的缺点，不能很好地在受体细胞发挥TGF-β3的调节作用。目前常用来增加细胞中细胞因子的表达量的方法主要是将细胞因子跟细胞共孵育，但是实际上这种方法并不能让细胞分泌的外泌体中该细胞因子的表达量明显增加。