[发明专利]一种真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱鉴定方法及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱鉴定方法，其特征在于：所述指纹图谱包括6对SSR标记，具体序列如下：

相应带型编号组合为：(8+16)/(1+2)/2/(14+11+13)/4/1。

2.权利要求1所述的真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括，

(1)菌丝培养：将真姬菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，22℃培养8d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：利用美基美真菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒实验步骤提取基因组DNA，并取2μl DNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；

(3)SSR分子标记引物开发：根据真姬菇菌株的基因组重测序结果，选取多态性序列设计20对SSR引物并合成；

(4)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；

(5)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与甲酰胺加样缓冲液混匀，变性，上机检测；

(6)GeneMapper数据分析。

3.根据权利要求2所述的真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)基因组DNA的提取，其具体方法包括：

(1)将真菌样本加入液氮充分研磨；

(2)向研磨好的粉末中迅速加入360μl Buffer STE和40μl Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；

(3)加入5μl RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；

(4)加入140μl Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；

(5)室温下，13000g离心5min，小心转移400μl上清液至新的离心管中；

(6)加入600μl Buffer PBD至样品中，涡旋混匀30s；

(7)把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；

(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；

(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μl Buffer GW2至柱子中，8000g离心1min；

(10)重复步骤9；

(11)倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；

(12)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μl预热至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；

(13)取2μl DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μl DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。

4.根据权利要求2所述的真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述PCR扩增，扩增体系为：总体积10μl，包括：10×PCR buffer 1μl，2.5mmol/l dNTP 0.8μl，5U/μl TAKARA HSTaq酶0.1μl，5μmol/lTP-M13 0.5μl,5μmol/lSSR标记特异引物总体积各0.6μl，浓度20ng～30ng/μl提取的模板DNA 1.2μl，ddH₂O 5.2μl；

PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min。

5.根据权利要求2所述的真姬菇荣白001(F)菌种的SSR标记指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)中，在96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，上述PCR产物1μl，混匀。