[发明专利]人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法

说明书

本发明是一种基于人工油体固定化多酶及其在塔格糖制备中的应用。本发明利用人工油体将表达的目标蛋白酶‑油体蛋白的融合蛋白与油体混合，超声处理，通过人体蛋白的特异疏水性将融合蛋白锚定到油体表面，形成含有目标蛋白酶的人工油体，从而实现酶的纯化和固定化同步完成。本发明提供的一种可用于塔格糖生产的固定化多酶，首次采用人工油体作为固定化酶基质，显著提高固定化酶的稳定性，降低了当前酶法制备塔格糖的生产成本，且制备工艺简单。

技术领域

本发明涉及一种以基因工程领域，具体涉及酶蛋白的表达以及制备固定化多酶生产塔格糖的方法。

背景技术

目前塔格糖主流生产方法是经过半乳糖异构化、脱盐、脱色、分离、浓缩、结晶等步骤制成塔格糖纯品。然而，这种方法也存在缺陷，半乳糖不能完全转化为塔格糖，最终产物是半乳糖和塔格糖的混合物，导致塔格糖分离工艺复杂，转化率低，分离成本高昂，同时原料半乳糖的价格并不低廉，最终塔格糖的生产成本高昂。(Rhimi M, Aghajari N, Juy M,Chouayekh H, Maguin E, Haser R, Bejar S: Rational design of Bacillusstearothermophilus US100l-arabinose isomerase: Potential applications for d-tagatose production. Biochim. 2009, 91:650-653. Oh H-J, Kim H-J, Oh D-K:Increase in d-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of l-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnol. Lett.2006, 28:145-149. Bosshart A, Hee CS, Bechtold M, Schirmer T, Panke S:Directed divergent evolution of a thermostable D-tagatose epimerase towardsimproved activity for two hexose substrates. ChemBioChem 2015,16:592-601.) 韩国CJ公司和中国科学院天津工业生物技术研究所均开发了一种体外多酶新路线合成塔格糖（WO2018004310A1，CN 109790524 A，CN107988286A，CN109666620A）。该塔格糖体外多酶合成新路线可以淀粉、麦芽糊精、蔗糖为原料，通过多步酶催化反应合成塔格糖，从根本上改变了现有异构化生产塔格糖的生产工艺。但是，该合成新路线涉及多个酶分子，酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能用于催化反应，导致酶的生产成本昂贵；而且生物酶是一种水溶性分子，在催化反应结束后水溶性酶分子难以回收再利用，造成酶的浪费。这些因素导致塔格糖合成新路径的生产成本较高昂，亟需开发一种多酶固定化方法，固定化塔格糖合成新路径中的多酶，使其能够重复利用，降低生产成本。

油体是植物种子尤其是油料植物种族的重要贮脂细胞器，油体结构模型是由单分子磷脂层和嵌于其内的油体结合蛋白包裹液态基质三酰甘油形成的弹性球体或椭球体，具有显著的物理稳定性和化学稳定性。油体在蛋白表达、纯化和固定化，益生菌、生物活性物质的包埋，作为乳化剂使用等生物技术领域得到了广泛的开发和应用。人工油体是在体外将主要成分三酰甘油、磷脂和油体蛋白按照一定比例混合，重新组合而成的稳定油体。人工油体的工艺流程如下：首先构建重组油体蛋白-目标蛋白表达载体，然后在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达重组融合蛋白；再将菌体破碎，离心收集沉淀，最后将其与磷脂和三酰甘油重组成人工油体。