[发明专利]基于肽图的单抗糖型检测方法

说明书

本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其是涉及一种基于肽图的单抗糖型检测方法。基于肽图的单抗糖型检测方法，包括如下步骤：(a)采用超高压液相色谱‑质谱采集肽图试样的质谱信号，获取不同糖型修饰的糖肽的分子量；(b)对照含有各种糖型修饰的糖肽的分子量的数据库，确定所述不同糖型修饰的糖肽所对应的糖型；所述肽图试样的制备包括：在液相环境中，采用变性剂和还原剂对单抗样品进行变性处理；再进行烷基化处理和酶切反应，然后终止酶切反应。本发明基于单抗样品的肽图分析单抗的糖型，解决了现有技术无法兼顾糖型分析效率和分析精度的技术问题。

技术领域

本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其是涉及一种基于肽图的单抗糖型检测方法。

背景技术

大部分人用治疗性单抗都是由哺乳动物细胞表达的，最常用的表达体系是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。CHO细胞所表达的单抗，其Fc片段上的主要N糖糖型为双天线型，同人源单抗上的N糖修饰类型及比例高度相似。而且，人们对CHO的N糖糖型研究比较成熟，可以非常便捷的获取CHO细胞的N糖糖库，为CHO的N糖表征提供了极大的便利。

传统的糖基化检测是在游离糖水平进行的，通过PNGase F等酶将N糖切下来，再进行衍生标记后，通过高效液相色谱进行分析。但这种检测方法，检测通量与自动化程度低，从拿到样品到获得结果需要3天左右的时间，对单克隆抗体细胞株的筛选造成极大的时间浪费，另外进行2-AA或2-AB标记后需要使用带有荧光检测器(FLD)的液质联用仪进行分析，这也就限制了其推广。

现有技术中为了提高检测效率，有在亚单位水平对N糖糖型进行检测。亚单位水平包括Fc片段和HC片段，这些亚单位上包含了N糖修饰各种信息，根据分子量及其强度可以推测出N糖的类型和丰度信息。但这种检测方法，由于肽段分子量远大于N糖分子量，导致对低丰度糖型(5％及以下)分析不准确，而且Fc或HC上还有其他各种翻译后修饰，可能会干扰质谱解析。

因而，如何提供一种可兼顾检测效率和检测精度的单抗糖型检测方法对于加快细胞株筛选的开发具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于肽图的单抗糖型检测方法，以解决现有技术中存在的无法兼顾对单抗糖型的检测效率和精度的技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

基于肽图的单抗糖型检测方法，包括如下步骤：

(a)采用超高压液相色谱-质谱采集肽图试样的质谱信号，获取不同糖型修饰的糖肽的分子量；

(b)对照含有各种糖型修饰的糖肽的分子量的数据库，确定所述不同糖型修饰的糖肽所对应的糖型；

所述肽图试样的制备包括：在液相环境中，采用变性剂和还原剂对单抗样品进行变性处理；再进行烷基化处理和酶切反应，然后终止酶切反应。

在本发明的具体实施方式中，还包括：获取质谱信号中不同糖型修饰的糖肽的强度，计算单个糖型修饰的糖肽的强度占所有糖型修饰的糖肽的强度的比例作为所述单抗样品中单个相应所述糖型所占的比例。

在本发明的具体实施方式中，确定所述不同糖型修饰的糖肽所对应的糖型的方法包括：将获取得到的不同糖型修饰的糖肽的分子量与所述数据库中的分子量进行比对，以偏差＜10ppm为准进行初步判断，然后利用二级质谱数据进行确定。

在本发明的具体实施方式中，所述变性剂为含4～8M尿素、pH为11～12的1～2M的Tris-HCl溶液；

所述还原剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、β-巯基乙醇和巯基乙胺中的任一种或多种。

在本发明的具体实施方式中，所述单抗样品的浓度为0.8～1.2mg/mL。进一步的，所述变性剂的体积为所述单抗样品的体积的3倍以上。