[发明专利]液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸序列特异性扩增引物和探针，其特征在于，序列如下：

寨卡病毒扩增引物和探针：

F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；

R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；

P（5’-3’）：NH₂(CH₂)₁₂-GTTCAACACAAGTTGGAGTG；

基孔肯雅病毒扩增引物和探针：

F（5’-3’）：GTAGGACCAAACTTCTCAAA；

R（5’-3’）：Biotin-TCTCGGCAGTAGATGACCACG；

P（5’-3’）：NH₂(CH₂)₁₂-GCGTAGCTATACCTCTCCTC。

2.一种液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸试剂盒，其特征在于，包括如下成分：

1）寨卡病毒和基孔肯雅病毒NS3基因序列检测特异性扩增引物和探针

寨卡病毒扩增引物和探针：

F（5’-3’）：GCTCCCAAGGAAGTAA；

R（5’-3’）：Biotin-CCTTCACCGCTTCTCAGC；

P（5’-3’）：NH₂(CH₂)₁₂-GTTCAACACAAGTTGGAGTG；

基孔肯雅病毒扩增引物和探针：

F（5’-3’）：GTAGGACCAAACTTCTCAAA；

R（5’-3’）：Biotin-TCTCGGCAGTAGATGACCACG；

P（5’-3’）：NH₂(CH₂)₁₂-GCGTAGCTATACCTCTCCTC；

2）寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸逆转录的cDNA

3）PCR扩增反应试剂：

EX-Taq酶，cDNA模板， dNTP混合液，10*EX-Taq buffer，ddH₂O；

4）微球偶联成分：

35号羧基微球，45号羧基微球，0.1M，pH4.5 的 MES（2-吗啉乙磺酸），EDC （1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐）溶液（10mg/ml），0.02% Tween 20，0.1%SDS，pH8.0的TE buffer；

5）微球杂交成分：

1.5×TMAC杂交缓冲液（500 mL）: 5M TMAC（四甲基氯化铵）450 mL，20% Sarkosyl（N-月桂酰肌氨酸）3.76 mL，1M Tris-HCl（pH8.0）37.5 mL，0.5M EDTA（pH8.0） 6 mL，H₂O2.74mL；

1×TMAC杂交缓冲液（250 mL）: 1.5×TMAC杂交缓冲液，H₂O ；

SA-PE（链霉亲和素-藻红素）（1mg/mL）。

3.一种液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒的RNA获取

使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)提取寨卡病毒和基孔肯雅病毒的RNA核酸；

2）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸逆转录成cDNA

利用Takara公司PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸逆转录成cDNA；

3）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸PCR扩增反应体系：

扩增条件为变性94 °C 5 min；变性94 °C 30s，退火52°C 30S，延伸72 °C 1min，共30个循环；延伸72 °C 5 min；

EX-Taq酶 0.5 μL

cDNA模板 5 μL

F( 10 μmol /L) 1 μL

R( 10 μmol /L) 1 μL

dNTP混合液 1 μL

10*EX-Taq buffer 3 μL

ddH2O 18.5 μL

合计 30μL

4）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的微球偶联步骤如下：

蜗旋仪上以最高转速悬浮微球；取 75μL 微球到1.5mL离心管中，最高转速离心2 分钟；

弃上清，用 50μL 0.1M，pH4.5 的 MES 重悬微球，彻底蜗旋，使微球分散；加入10μmol/L探针3μL；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μL EDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗推荐下孵育 30min；制备新鲜的 EDC 溶液（10mg/ml），加入 6μLEDC至微球中，彻底混匀，室温黑暗条件下孵育 30min；加入 1mL 0.02% Tween 20，稍微蜗旋混匀，最高转速离心1-2min，弃上清；用 0.1%SDS 重悬沉淀40s，最高转速离心2 分钟；用 500μL pH8.0 TEbuffer 重悬沉淀，蜗旋仪上最高转速蜗旋 30s；4℃ 黑暗条件下储存；

5）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的微球杂交步骤如下：

充分重悬偶联核酸探针的微球混合液；在每个样品孔和背景孔，加入微球工作液10 μL；然后加入33 μL核酸检测缓冲液1（1.5×TMAC）；在每个背景孔中，加入7 μL PCR blank产物；在每个样品孔，加入7 μL PCR产物；充分混匀，于恒温混匀器中进行如下反应：95℃变性5min；52℃杂交30min；在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2（1×TMAC）将SA-PE（1mg/ml）稀释至4μg/ml，制备新鲜的报告液；在每个反应孔中加入50μL的报告液，充分混匀；于金属加热器中52℃孵育10min；

6）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的杂交产物的检测

依照液相芯片检测仪Luminex200的说明书对100μL上述杂交反应液进行检测；

7）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的实验结果判断标准的确立

根据液相芯片检测方法的判断标准，基孔肯雅病毒和寨卡病毒液相芯片检测实验结果的判断标准设定如下：

1）数据有效性分析：空白对照与寡核苷酸探针杂交荧光强度中值不高于100；

2）待测样本分析判断：Cutoff值为250，当待测样本的荧光强度中值不高于100时，判定为阴性样本；待测样本的荧光强度中值≥250时，判定为阳性样本；当150≤荧光强度中值＜250时，设置为灰度区间，判定为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证；

8）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的特异性

寨卡病毒的特异性以登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸为对照，进行PCR扩增及液相芯片检测，确定以NS3基因为基础的液相芯片检测寨卡病毒核酸的特异性；

基孔肯雅病毒的特异性以登革病毒核酸、寨卡病毒核酸、乙脑病毒核酸、黄热病毒核酸为对照，进行PCR扩增及液相芯片检测，确定以NS3基因为基础的液相芯片检测基孔肯雅病毒核酸的特异性；

9）液相芯片技术双重检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸的灵敏性

将制备的寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸用分光光度计进行定量，采用10倍倍比稀释，进行多重PCR扩增及液相芯片检测。