[发明专利]一种草鱼动脉球组织细胞系及其应用

说明书

本发明公开了一种草鱼动脉球组织细胞系，命名为草鱼动脉球组织细胞系CiBA，该细胞系于2019年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201980，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。该细胞系能在低至3％血清培养液中生长良好，目前已经稳定传至100代以上，冻存后细胞复苏率90％以上，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。该细胞系对于草鱼出血病毒Ⅱ型、草鱼出血病毒GCHV‑892毒株非常敏感，可用于草鱼出血病疫苗的生产。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种草鱼动脉球组织细胞系CiBA及其应用。

背景技术

草鱼是鲤科、草鱼属鱼类，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。草鱼是中国重要的淡水养殖鱼类，它和鲢、鳙、青鱼一起，构成了中国的“四大家鱼”。在养殖过程中，草鱼容易发生各种疾病，而近年来由于各地忽视了免疫工作，草鱼出血病的发病率呈上升趋势。草鱼出血病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV，国际病毒分类委员会称之为reovirus of grass carp,GCRV)是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。

目前草鱼出血病病原公认的至少有3个基因型，最早于1980年分离和研究的属于基因I型(如GCHV-873株等)；而张超、王庆等于2010年首次报道了II型草鱼出血病病毒，GCHV-HZ08株；Fan YD,Rao SJ等于2009年在国内首次分离并报道了III型草鱼出血病病毒：HGDRV(GCHV-104株)；不同基因型毒株间的各节段序列同源性相似性为15.1-46.1％不等，且不同基因型的交叉保护率低，这也就意味着即使免疫过单种疫苗，也仍然会有被其他基因型病原感染的风险。目前，草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)已经能够对基因I型达到较好的免疫保护作用。而II型GCRV作为目前主要流行株型，对草鱼的致病性较强、致死率高，尚没有针对性的高效疫苗。

鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需求鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。草鱼吻端成纤维细胞系PSF是目前草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)生产用细胞系，已经在草鱼出血病毒培养和疫苗生产领域得到了广泛应用，但是汇合度为80-90％的PSF细胞贴壁培养2-3天后，细胞生长为长梭形，对病毒的敏感性下降。草鱼出血病II型在细胞上不产生病变，在目前常用于分离GCRV的CIK、PSF、FHM、EPC等细胞系上扩繁拷贝数低，难以满足草鱼呼肠孤病毒II型的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究的要求。为了研究及预防该病毒，技术人员需要一种对草鱼出血病毒有更强敏感性的细胞系。

动脉球(aortic bulb)亦称大动脉球，是硬骨鱼类所特有的组织，指硬骨鱼类的心脏从心室前方发出的动脉干(腹大动脉)起始处的球状肥厚部。动脉球是心脏的辅助器官，具有由平滑肌纤维构成的强韧的肌壁，收缩时送出血液，与软骨鱼动脉圆锥位置相同(硬骨鱼类动脉圆锥逐步消失，被动脉球替代)，但动脉球无瓣膜。动脉圆锥是心室的延伸；动脉球则是腹大动脉基部的膨大，因而动脉球不具横纹肌只具平滑肌，不能搏动，内部也无瓣膜，用于提高并维持血压。但是，目前还没有关于草鱼动脉球细胞系的报道，更没有关于草鱼动脉球细胞系用于培养草鱼出血病病毒的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明以草鱼动脉球组织为对象，成功构建了草鱼动脉球组织细胞系，该细胞系细胞活力相对较高，对草鱼出血病毒的敏感性较高，不仅能用于草鱼出血病病毒的增殖，还能用于草鱼出血病疫苗的生产。