[发明专利]一种草鱼输尿管组织细胞系及其应用

说明书

本发明公开了一种草鱼输尿管组织细胞系，命名为草鱼输尿管组织细胞系CiU，该细胞系于2019年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201978，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。该细胞系能在低至3％血清培养液中生长良好，目前已经稳定传至100代以上，冻存后细胞复苏率90％以上，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。该细胞系对于草鱼出血病毒Ⅱ型、草鱼出血病毒GCHV‑892毒株非常敏感，可用于草鱼出血病疫苗的生产。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种草鱼输尿管组织细胞系CiU及其应用。

背景技术

草鱼是鲤科、草鱼属鱼类，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。草鱼是中国重要的淡水养殖鱼类，它和鲢、鳙、青鱼一起，构成了中国的“四大家鱼”。在养殖过程中，草鱼容易发生各种疾病，而近年来由于各地忽视了免疫工作，草鱼出血病的发病率呈上升趋势。草鱼出血病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV，国际病毒分类委员会称之为reovirus of grass carp,GCRV)是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。

目前草鱼出血病病原公认的至少有3个基因型，最早于1980年分离和研究的属于基因I型(如GCHV-873株等)；而张超、王庆等于2010年首次报道了II型草鱼出血病病毒，GCHV-HZ08株；Fan YD,Rao SJ等于2009年在国内首次分离并报道了III型草鱼出血病病毒：HGDRV(GCHV-104株)；不同基因型毒株间的各节段序列同源性相似性为15.1-46.1％不等，且不同基因型的交叉保护率低，这也就意味着即使免疫过单种疫苗，也仍然会有被其他基因型病原感染的风险。目前，草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)已经能够对基因I型达到较好的免疫保护作用。而II型GCRV作为目前主要流行株型，对草鱼的致病性较强、致死率高，尚没有针对性的高效疫苗。

鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需求鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。草鱼吻端成纤维细胞系PSF是目前草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)生产用细胞系，已经在草鱼出血病毒培养和疫苗生产领域得到了广泛应用，但是汇合度为80-90％的PSF细胞贴壁培养2-3天后，细胞生长为长梭形，对病毒的敏感性下降。草鱼出血病II型在细胞上不产生病变，在目前常用于分离GCRV的CIK、PSF、FHM、EPC等细胞系上扩繁拷贝数低，难以满足草鱼呼肠孤病毒II型的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究的要求。为了研究及预防该病毒，技术人员需要一种对草鱼出血病毒有更强敏感性的细胞系。

一般的鱼类有一对输尿管，肾脏过滤的新陈代谢废物由肾小管汇集到输尿管，借助输尿管肌肉壁的蠕动将尿液排出体外。输尿管壁具有三层：粘膜层、肌肉层、纤维层。粘膜层有较多纵行皱褶；肌肉层里层为纵肌，外层为环肌，均属于滑肌；纤维层有较多弹性结缔组织、血管、神经分布期间。但是，目前还没有关于草鱼输尿管组织细胞系的报道，更没有关于草鱼输尿管组织细胞系用于培养草鱼出血病病毒的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明以草鱼输尿管组织为对象，成功构建了草鱼输尿管组织细胞系，该细胞系不仅能用于草鱼出血病病毒Ⅱ型的增殖，还能用于草鱼出血病疫苗的生产。

本发明所述的草鱼输尿管组织细胞系的生物学名称为草鱼输尿管组织细胞系CiU，该细胞系于2019年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201978，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。