[发明专利]重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法及应用

权利要求书

1.一种重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法，其特征在于：重组表达质粒的载体为pCOLADuet-1，所述重组表达质粒包含：一段编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸；所述编码重组型蛋白表达产物基因的聚核苷酸包括在宿主细胞中表达蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主细胞为产透明质酸的兽疫链球菌；包括如下步骤：

第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，连接到所述载体pCOLADuet-1上，构建表达载体pCOLADuet-1- S1；

引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；

引物2：5′-TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCG-3′；

第2步：将步骤1中构建的表达载体pCOLADuet-1-S1导入宿主产透明质酸的兽疫链球菌得到重组兽疫链球菌工程菌株，并利用培养基进行菌种发酵培养；

第3步：发酵培养基为：葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 30g/L、玉米浆20g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、MgSO₄ 5g/L、FeSO₄·7H₂O 0 .01g/L、MnSO₄·H₂O 0 .01g/L、谷氨酰胺1 .5g/L、精氨酸0 .5g/L；

发酵过程温度控制在32℃，转速为200转/分钟，在发酵3h时，加入10 .0M乳糖诱导蛋白酶的表达和透明质酸的产生，发酵72h后检测发酵液中透明质酸的含量；

所述表达蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

所述的蛋白酶基因的聚核苷酸编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组表达质粒构建透明质酸工程菌株的方法，其特征在于所述的蛋白酶基因通过PCR扩增获得。

3.一种透明质酸的制备方法，其特征在于采用权利要求1或2中透明质酸的发酵液，包括破壁工序、分离工序、提取工序和水解工序；

所述破壁工序指在具有透明质酸的发酵液中加入几丁质酶进行破壁处理，获得具有透明质酸的兽疫链球菌原生质体的处理液；

所述分离工序将含有透明质酸的悬浊混合液温度提升到55-60℃，将透明质酸从破壁处理的细胞中分离出来；

所述提取工序指将混合液用0.22μm的过滤纸板过滤，去除含有透明质酸的原生质体，提取获得透明质酸；

所述水解工序是指将获得的透明质酸溶液加入透明质酸酶，酶解4h后，得到水解液，并通过超滤膜进行过滤截留，得到低分子量透明质酸滤液。

4.根据权利要求3所述的透明质酸的制备方法，其特征在于所述破壁工序反应温度为35-45℃，所述几丁质酶的添加量为处理液质量的0.2-1.2‰。

5.根据权利要求4所述的透明质酸的制备方法，其特征在于所述水解工序中：透明质酸酶的添加量为高分子量透明质酸溶液体积的0 .5％-10％；酶解的温度为30-50℃；酶解的pH值为4 .5-7 .0。

6.根据权利要求5所述的透明质酸的制备方法，其特征在于含有所述透明质酸的悬浊混合液为透明质酸和内容物中含有蛋白的透明质酸菌体原生质体的混合物。