[发明专利]一种重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)。本发明还提供了上述重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的制备方法和应用。本发明利用CBP‑SBP作为融合标签，可高效促进溶组织梭菌I型胶原酶(ColG)可溶表达，避免了包涵体复性，有利于纯化降低生产成本，能够满足工业化生产的需求。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种高纯度重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用。

背景技术

溶组织梭菌型胶原酶(Collagenase Clostridium Histolyticum)为BioSpecifics Technologies集团原研的药物，其于2010年2月2日获得美国食品药品管理局(FDA)批准，2011年2月28日获得欧洲药物管理局(EMA)批准，2015年7月3日获得日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市。商品名为的产品由Auxilium制药(现在的远藤制药，Endo International)在美国市场销售，由旭化成(Aasahi Kasei)在日本市场销售。商品名为的产品由Swedish Orphan Biovitrum(SOBI)在欧洲市场销售。此外，商品名为和的产品由BioSpecifics Technologies集团销售。

批准的适应症有杜普征氏掌挛缩(Dupuytren’s contracture)、佩罗尼病(Peyronie’s disease)以及橘皮组织(Cellulite)。是第一个获FDA批准用于佩罗尼病男性患者的非手术治疗选择。由梭菌属I型胶原酶(AUX-I)和梭菌属II型胶原酶(AUX-II)，按1:1的质量比混合而成。AUX-I和AUX-II均为单一肽链，分别由溶组织梭菌的ColG和ColH编码，二者都是锌离子、钙离子结合的金属酶。

生理学条件下胶原酶的作用是水解天然三重螺旋构象的胶原，可使沉积胶原溶解。注射到杜普征氏掌挛缩患者的可触摸结缔中或佩罗尼病患者的阴茎硬结中(二者主要成分就是沉积的胶原)使之破坏。体外研究表明AUX-I和AUX-II依据各自不同的底物亲和性、水解效率以及选择性切割位点而发挥协同作用。

原研公司BioSpecifics是通过培养溶组织梭菌，从发酵上清液中纯化AUX-I和AUX-II。但是溶组织梭菌本身是一种气性坏疽的致病菌，从其发酵上清液常常混杂各种毒素，成分复杂，如果没有原研公司的菌株以及生产和纯化工艺，很难保证得到达到药用标准的精制品。用基因重组技术生产溶组织梭菌I型胶原酶是解决这个问题的可能途径，但由于AUX-II分子量较大(113kD)，常规大肠杆菌表达难以实现。即使表达大都在胞内积累，易形成包涵体。包涵体复性过程复杂、技术难度大、得率低、生产成本高，当前尚不能应用于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备重组溶组织梭菌I型胶原酶的易于高效表达的标签蛋白，该融合标签蛋白包括来源于钙调蛋白结合肽与链球菌抗生物素蛋白结合肽的串联组合(CBP-SBP)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。该融合标签蛋白还包括：转录终止抗终止因子(NusA)，或者大肠杆菌硫氧还蛋白A(TrxA)，或者二硫键氧化还原酶(DsbA、DsbC)，或者谷胱甘肽S-转移酶(GST)。所述融合标签蛋白能促进重组溶组织梭菌I型胶原酶的可溶高效表达，且不影响重组溶组织梭菌I型胶原酶的生物活性。

本发明首先提供了一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)；

优选地，所述钙调蛋白结合肽(CBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；