[发明专利]一种快速区分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM检测方法

权利要求书

1.一种快速区分稻瘟病菌交配型的荧光PCR-HRM检测引物组，包括MAT1-1扩增引物组和MAT1-2扩增引物组；

所述MAT1-1扩增引物组包括MAT1-1-F和MAT1-1-R；

所述MAT1-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述MAT1-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述MAT1-2扩增引物组包括MAT1-2-F和MAT1-2-R；

所述MAT1-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述MAT1-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种包括权利要求1所述引物组的荧光PCR-HRM检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于荧光PCR扩增的试剂。

3.一种基于权利要求1所述引物组或者权利要求2所述试剂盒的荧光PCR-HRM检测区分稻瘟病菌交配型的方法，包括以下步骤：

1)提取待区分稻瘟病菌的基因组DNA；

2)以所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行荧光PCR扩增反应，得到待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物；

3)对所述待区分稻瘟病菌荧光PCR扩增产物进行熔解曲线分析，得到待区分稻瘟病菌熔解温度；

当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为78～80℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当所述待区分稻瘟病菌熔解温度为82～84℃时，则所述待区分稻瘟病菌为MAT1-2交配型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应体系以10μL计，包括以下组分：待区分稻瘟病菌的基因组DNA 3μL、10×buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、0.5U Taq DNA Polymerase 0.1μL、所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R各0.2μL以及余量的ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待区分稻瘟病菌的基因组DNA的浓度为10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg²⁺，所述Mg²⁺的浓度为20mM；所述dNTP的浓度为2.5mM；所述引物组中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R的浓度分别为0.1mM。

6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述荧光PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述熔解曲线分析的程序为：95℃，变性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1s，进行熔解曲线分析。

8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述熔解曲线分析采用的软件包括LightCycler96。