[发明专利]一种测定烟丝中氨基酸的方法

说明书

本发明公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，包括以下步骤：(1)标准曲线的建立：用UPLC—检测器测定衍生化的氨基酸标准工作液，绘制出标准曲线，色谱条件包括：流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，在甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；流速0.7mL/min，并对梯度洗脱程序进行限定；(2)烟丝中氨基酸的测定：用UPLC—检测器测定衍生化的烟丝提取液，外标法计算烟丝中各氨基酸的含量，且超高效液相色谱检测的色谱条件与步骤(1)中相同。本发明8.5min即可完成烟丝中21种氨基酸的测定。

技术领域

本发明涉及烟草检测技术领域，特别涉及一种测定烟丝中氨基酸的方法。

背景技术

游离氨基酸作为烟草中的重要化合物，其种类及含量对烟草品质影响很大。烟草在生长、调制、工业加工及燃烧的过程中，游离氨基酸与烟草中的还原糖发生反应，生成吡啶、吡喃、吡嗪等一系列具有香味特征的杂环化合物；某些氨基酸如苯丙氨基酸还可以自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇。因此，游离氨基酸在烟草质量控制及卷烟配方优化中具有重要的作用。

目前，氨基酸的分析方法主要有气相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(离子色谱法)、氨基酸分析仪法及液相色谱法。高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸首先是利用衍生剂将氨基酸衍生为极性小且具有荧光性的衍生物，然后使用荧光或伏安检测器进行检测，液相色谱法可采用柱前或柱后衍生，具有方法灵活、灵敏度高、分析时间短等优点。超高效液相色谱(UPLC)，采用细粒径的填料(一般为1.7μm)和高压分离系统，与高效液相色谱(HPLC)相比，减短了分析时间，提高了灵敏度及分离度，同时减少了溶剂用量，节约成本。

高效液相色谱法(HPLC)常用的衍生剂有：邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-Cl)、2,4-硝基氟苯(DNFB)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)等。使用上述这些衍生剂进行衍生并使用高效液相色谱法(HPLC)进行分析还存在衍生效率低，测定时间长的问题。目前，Waters公司推出AQC衍生剂包，称其能同时与一、二级氨基酸反应，衍生物稳定，多余的衍生剂可在1min内水解，且具有水解产物不干扰测定等优点。有小组以Waters公司推出的AQC衍生剂包衍生-UPLC法分别测定烟草中17、18种游离氨基酸，但是他们均未进行天冬酰胺(Asn)、4-氨基丁酸(γ-Aba)的测定。天冬酰胺是烤烟中重要的游离氨基酸之一，在大多数烤烟中其含量仅次于脯氨酸。天冬酰胺分子中含有两个氮原子，在烟草燃吸过程中，热裂解产物比其他氨基酸更复杂，会产生氢氰酸、丙烯酰胺等有害成分；而γ-氨基丁酸是在自然界植物、动物以及微生物中广泛存在的一种非蛋白质的氨基酸，具有重要的生理功能。因此，在中华人民共和国烟草行业标准《YC/T282-2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪》中，对烟叶的氨基酸测定是21种。但是该方法需要氨基酸分析仪这种专门仪器设备，且需要烟末1g来进行提取和衍生，超声提取30min，衍生、分离和测定共需要122min，总时间152min。程勇等,柱前衍生UPLC法测定烟叶中20种游离氨基酸含量[J]烟草科技,2010,8-34-40中，需要烟末1g来进行提取和衍生，超声提取30min，用预处理好的732型阴离子交换柱，95mL4mol/L的氨水洗淋，收集，旋干，这一段时间不详，经评测至少30min；加80mL0.1mol/L的盐酸溶解，离心10min，取上清液定容至50mL，得样品液；取0.5mL+0.2mL衍生剂溶液(1％的2,4-二硝基氟苯溶液得乙腈溶液)，600℃衍生1h，定容，过膜，进UPLC检测，UPLC的检测时间60min；这种方法共计花费时间30+30+10+60+60＝190min。

前述的Waters公司自制了一套专门用来衍生氨基酸并进行HPLC测定的氨基酸分析方法，其售出的AQC衍生剂包(包括衍生剂和流动相试剂包，即AccQ-TagEluentA溶液，AccQ-TagEluentB溶液；AccQ-Fluor试剂盒)价格昂贵，对进行大批样品分析不利。