[发明专利]一种酿酒酵母表达人rKGF-1-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达人rKGF‑1‑HSA融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑Mfα‑rKGF‑1‑HSA的构建；(2)rKGF‑1‑HSA融合蛋白工程菌的制备、转化；(3)INVSc1/pYES2/CT‑Mfα‑rKGF‑1‑HSA工程菌的诱导表达和纯化。同时还提供了一种酿酒酵母表达长效重组人rKGF‑1‑HSA融合蛋白标准品的制备方法。本发明利用酿酒酵母表达人KGF‑1与HSA融合而成的重组蛋白(rKGF‑1‑HSA)，生产工艺简单、成本低、产物均一。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达人rKGF-1-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法。

背景技术

角质细胞生长因子-1(keratinocyte growth factor-1,KGF-1)，最早由R ubin等发现存在于胚胎肺成纤维细胞的培养上清中，是成纤维细胞生长因子(f ibroblastgrowth factors,FGFs)家族的成员之一，又被称为FGF-7。人KG F-1分子量为26-28kDa，分子量的差异是由多肽链结合的糖蛋白不同引起的。人KGF-1的cDNA编码的是1条194个氨基酸(前31个氨基酸编码信号肽)的单链多肽。研究发现在上皮细胞膜上存在其特异性受体FGFR，在间质细胞中产生的KGF-1通过旁分泌途径与其结合，从而促进上皮细胞的增殖与分化。KGF-1的生物学作用主要有促进有丝分裂、促进细胞迁移、调控细胞分化、抗凋亡和细胞保护等作用。

目前KGF-1的获得主要通过两条途径：一是从生物的组织细胞中提取；二是运用基因工程技术构建表达载体，利用宿主表达重组KGF-1。天然提纯KGF-1工艺复杂、成本高，其推广应用受到了限制。而利用基因工程技术表达外源基因已成为获取目的蛋白的高效途径之一，根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达。原核表达系统虽成本低廉，但该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷，而利用真核表达系统能够对蛋白进行翻译后修饰，往往能获得较高生物学活性的目的蛋白。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人体血液中的主要蛋白，由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/L。HSA由肝脏合成，血清半衰期长，可达19天。HSA在调节血液渗透压、营养和促进伤口愈合等方面发挥重要作用，广泛用于肝硬化腹水、烧伤、休克等临床治疗。此外，HSA具有无免疫原性、人体相容性好、组织分布广和无酶活等特性，使其成为非常理想的重组蛋白融合载体。通过构建融合蛋白技术能够增加重组蛋白的分子量从而延长半衰期，有效的提高重组蛋白的稳定性。

对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，这些方法本身变异性较大。因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。天然提纯KGF-1工艺复杂、成本高，其推广应用受到了限制。而利用基因工程技术表达外源基因已成为获取目的蛋白的高效途径之一，根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达。原核表达系统虽成本低廉，但该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷。

发明内容

为克服背景技术中的技术问题，本公司利用酿酒酵母表达的重组人KGF-1与HSA融合而成的重组蛋白(rKGF-1-HSA)，生产工艺简单、成本低、产物均一，建立了一种经济、高效、稳定表达的高浓度、高活性的长效重组人KGF-1标准品蛋白，为建立长效人KGF-1蛋白质量标准提供依据。

一种酿酒酵母表达人rKGF-1-HSA融合蛋白制备方法，包含以下步骤：

(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA的构建，具体包括：

设计并获得KGF-1-HSA基因序列和融合蛋白rKGF-1-HSA的氨基酸序列；