[发明专利]水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用

权利要求书

1.水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，其特征在于，在水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标片段，采用pBWA(V)H-cas9质粒为表达载体，将水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取的靶标片段的靶序列插入到pBWA(V)H-cas9质粒，然后将得到的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒再转化到籼稻炳1B中，经PCR检测以及一代测序筛选得到的株高提高、粒型改善的OsMAPKKK5基因突变株cas9-MAPKKK5-2-1或cas9-MAPKKK5-3-8。

2.如权利要求1所述的水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，其特征在于，所述的水稻OsMAPKKK5基因的CDS区域选取靶标片段的靶序列如SEQ.ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，其特征在于，所得的株高提高、粒型改善的OsMAPKKK5基因突变株的靶序列如SEQ ID NO.11所示。

4.如权利要求1所述的水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，其特征在于，其特征在于所述的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒转化到籼稻炳1B中，其具体步骤如下：

将籼稻炳1B成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上进行诱导愈伤，26-28℃培养约15-20天后继代一次得到籼稻炳1B愈伤组织，采用农杆菌介导法，将经纯化的载体pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒导入籼稻炳1B愈伤组织细胞，即完成pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒到籼稻炳1B的转化。

5.如权利要求4所述的水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用，其特征在于，所述的pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒采用农杆菌介导法导入籼稻炳1B愈伤组织细胞，其具体步骤如下：

S1、pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的转化农杆菌EHA105 具体包括如下步骤：

①按体积百分比为10%的比例，将含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒加入到农杆菌EHA105感受态细胞中，依次冰上放置30min、浸入液氮中5min，37℃水浴5min，得到含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞；

② 按体积百分比为22%的比例，将上述得到的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105感受态细胞加入到不加抗生素的LB液体培养基控制温度为28℃、转速为150-160rpm培养3-4h，得到培养液；

③将上述所得的培养液控制转速4000 rpm离心10min收集菌体，将离心收集到的菌体用为培养液体积11%的离心后所得的上清混匀，然后涂在含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB平板培养基上28℃培养36-72h，在LB平板培养基上形成菌斑；

PCR鉴定成功的菌斑即为含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105；

挑取PCR鉴定成功的菌斑1个进行1.5ml EP管接菌并置于28℃摇床中培养，这样就得到了含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液；

上述1.5ml EP管中含有1ml的含有20ug/ml利福平、40ug/ml庆大霉素和50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基；

S2、籼稻炳1B成熟种子愈伤的诱导与培养：

籼稻炳1B成熟种子去壳，在无菌条件下，先用75%乙醇浸洗10-15min，无菌水清洗3-5次，转入0.1%升汞浸泡20-30 min，无菌水清洗3-5次，接种于诱导培养基中进行诱导愈伤，26-28℃黑暗条件下培养，15-20天后选取愈伤组织继代培养,得到籼稻炳1B愈伤组织；

S3、农杆菌侵染:

①将含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌EHA105种子液按体积比为10-11%的接种量接种至YEP液体培养基中，控制温度为26-28℃培养12-16h,收集菌液,并用YEP液体培养基（YEP液体培养基：按每升计算含有：牛肉浸膏10g，酵母提取液10g，NaCl 5g，pH=7.0，余量为水）进行稀释，至含pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液浓度为OD600≈0.5；

②将S2中得到的籼稻炳1B愈伤组织在无菌滤纸上晾一下，然后一次性转入到OD600≈0.5的含有pBWA(V)H-cas9-OsMAPKKK5重组质粒的农杆菌的菌液中并混合均匀，然后控制转速为150rpm浸泡10～30 min，然后倒出菌液，得到被感染的愈伤组织；

③将步骤②所得的被感染的愈伤组织在无菌滤纸上放置至菌液吸干，然后转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，控制温度为26-28℃暗培养5～7天，得到被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织；

S4、抗性愈伤组织的筛选:

①将步骤S3所得的被农杆菌EHA105侵染的愈伤组织取出，并用无菌水清洗3-5次，再用含50mg/L利福平与50mg/L卡那霉素的无菌水清洗2-3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤组织转移至初级筛选培养基中，进行初级筛选15-20min，重复上述动作2-3次，得到弱抗性愈伤组织；

②将①中弱抗性愈伤组织再转移至次级筛选培养基中，控制温度为26-28℃的条件下进行次级筛选15-20天，筛选完成后，得到强抗性愈伤组织。