[发明专利]靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及结构类似物新应用

说明书

本发明公开了一种质粒pcore‑HU‑SMAR，其骨架载体是质粒PCMV‑Gluc，在骨架载体中插入有：HiBiT‑unaG融合基因，HiBiT‑unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，HiBiT‑unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因。还公开了由质粒pcore‑HU‑SMAR转染AML12得到的靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型。还公开了Triciribine及其结构类似物在制备抑制HBV核心启动子转录和/或HBV复制的药物中的应用或在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种靶向HBV核心启动子的药物筛选细胞模型、Triciribine及其结构类似物的新应用。

背景技术

目前，全球乙肝病毒携带者约有3.5亿患者，我国6-7％的人群(约8000万)处于病毒携带状态。病毒携带者可发展为慢性乙型肝炎，慢乙肝患者与普通人群相比，发生肝硬化、肝癌的风险更高，全球每年约100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。因此，治疗慢性HBV感染，阻止其致死性后果是事关公共健康的重要问题。

目前，用于乙肝治疗的药物包括α干扰素(IFN-α，PEG-IFNα)和6种核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、替诺福韦阿拉酚胺)。长效干扰素治疗48周后，仅少数患者可获得持续应答，且副作用明显。核苷(酸)类似物在大多数患者中均表现出较强的病毒抑制效果，它们可在一定时期内降低多数患者的血清HBV载量，改善转氨酶水平及肝脏组织学表现。然而，核苷(酸)类药物治疗也存在停药后反弹，长期用药可能筛选耐药突变株的问题。总之，现有治疗药物还远不足以彻底解决乙肝问题。正因为如此，开发新型抗HBV药物十分必要。

对HBV而言，有效的药物靶点应该针对病毒生活周期的关键环节。众所周知，共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV生命周期的一个关键分子。病毒感染细胞后，其松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)基因组转运入核，转变成游离于染色体的cccDNA。cccDNA是所有HBV病毒mRNA的转录模板，它的持续存在，也是现有抗病毒治疗后病毒持续存在或反弹的主要原因。阻断并清除细胞内cccDNA库，可以完全清除HBV，已成为领域内的普遍共识。然而，目前各种抗病毒治疗方案中，缺少以cccDNA为靶点的药物。

靶向cccDNA的药物，最终可以通过两种途径发挥作用：降低cccDNA的数量或者抑制其功能。cccDNA的主要功能，是作为所有HBV mRNA的转录模板，这些mRNA中很重要的是pgRNA，因其是子代病毒DNA合成的模板，同时也是核心蛋白和聚合酶的翻译模板。控制pgRNA转录的，是核心启动子。因此，抑制核心启动子的转录活性，即是在很大程度上抑制了cccDNA的功能。然而，目前为止，尚无能有效抑制核心启动子转录活性的药物上市。

发明内容

本发明的发明人在研究过程中，构建了一种靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型，然后利用该模型，进行了化合物筛选，筛选到了能抑制HBV核心启动子转录和HBV复制的化合物，这些药物具有进一步发展为乙肝治疗候选药物的潜力。基于此，本发明要求保护如下技术方案：

一种质粒pcore-HU-SMAR，其骨架载体是质粒PCMV-Gluc，在所述骨架载体中插入有：由HBV核心启动子驱动表达的HiBiT-unaG融合基因，所述HiBiT-unaG融合基因通过T2A序列与嘌呤霉素抗性基因相连，在嘌呤霉素抗性基因和polyA序列之间插入SMAR序列，所述HiBiT-unaG融合基因是荧光素酶标签HiBiT和荧光蛋白报告基因UnaG的融合基因，所述SMAR序列是位于人IFNβ基因上游的序列。