[发明专利]一种Gymnodimine毒素标准物质的制备方法

说明书

本发明公开了一种Gymnodimine(GYM)毒素标准物质的制备方法，包括以下步骤：采用优化设计的控制参数间歇式补给CO₂的方式，应用光生物反应器大规模培养产生GYM的海洋微藻；使用醇类有机溶剂从藻细胞中提取毒素，并用固相萃取柱对毒素粗提液进行初步净化，去除盐基质；再经葡聚糖凝胶层析色谱柱去除样品中的大部分色素；最后应用半制备液相色谱进一步纯化，将收集的毒素组分去溶剂后复溶得到毒素标准物质。本发明利用光生物反应器大规模培养产毒藻，培养过程简捷、高效，可提供稳定的毒素来源。同时，利用葡聚糖凝胶层析色谱和半制备液相色谱技术进行分离纯化，制备毒素标准物质的回收率高，且纯度达95％以上，与目前国际商业化的同类产品的质量相当。

技术领域

本发明属于天然产物分离技术领域，具体内容是从一种海洋甲藻中分离制备高纯度的Gymnodimine(GYM)毒素标准物质的方法。

背景技术

裸甲藻亚胺毒素(GYM)是一类具有螺旋形环亚胺结构的海洋脂溶性贝类毒素，通过小鼠腹腔注射可导致小鼠短时间内死亡，因此被称为“快速作用毒素”。1994年，研究人员在新西兰南岛生长的牡蛎(Tiostrea chilensis)样品中首次发现了GYM毒素，随后在世界很多近岸海域采集的贝类样品中被频繁检出。目前已知的GYM同系物共有八种，其中GYM-A最为常见(图1)，其分子式为C₃₂H₄₅NO₄，分子质量为507.335g/mol。GYM的来源生物主要有鞍状凯伦藻(Karenia selliformis)和奥氏亚历山大藻(Alexandrium ostenfeldii)，其中鞍状凯伦藻可产生GYM-A和少量的GYM-B。

目前，因食用GYM染毒贝类引起的人中毒事件尚未见报道，但研究发现该毒素可促进肿瘤的发育，且具有一定的不可逆性。因此，GYM毒素沿食物链向高营养级生物传递，经长期积累可影响海洋贝类捕食者及人体健康，潜在威胁海洋生态安全和贝类海水养殖经济的可持续发展。

随着海洋生物毒素在食品安全和医药开发领域的研究不断深入，对毒素标准物质的需求量越来越大。然而，目前国内缺少GYM毒素标准物质的商品化供应，全球只有加拿大国家研究理事会(NRC)下属的计量科学与标准物质中心(原海洋生物科学研究所)能够提供，且价格非常昂贵，不含关税的价格超过60万元/mg。我国目前仅有一些麻痹性贝毒、腹泻性贝毒等标准物质的制备研究工作，尚未见有关GYM毒素标准物质制备技术的报道，严重制约了GYM毒素检测以及相关的毒理学研究，使其成为一个亟待解决的瓶颈问题。因此，开展GYM毒素分离制备技术的研究可以在一定程度上解决国内毒素标准物质匮乏的问题，具有重大的经济、社会效益，同时为GYM毒素的科学研究及水产品质量控制、海洋环境污染风险评估等工作奠定基础。

发明内容

本发明提供一种Gymnodimine毒素标准物质的制备方法，即提供一种应用产毒藻规模化培养，分离纯化获得高纯度GYM毒素的制备技术方法，从而解决缺少商业化GYM毒素标准物质的问题。

本发明所提供的一种Gymnodimine毒素标准物质的制备方法，是将收集的产Gymnodimine毒素的藻体使用有机溶剂进行提取，提取液经固相萃取柱初步纯化，再使用葡聚糖凝胶层析色谱柱进行纯化，然后利用半制备液相色谱进一步分离纯化，将获得的毒素组分去溶剂后复溶得到Gymnodimine毒素标准物质。

作为一种具体的操作，本发明的方法包括如下步骤：

1)使用光生物反应器对产Gymnodimine毒素藻类进行大规模培养，收集藻体，然后使用有机试剂提取获得GYM毒素粗提液；

所述的有机溶剂，作为实施例的一种具体记载，为醇类溶剂；

2)将有机试剂提取的GYM毒素粗提液加入到活化后的固相萃取柱(SPE)中，以20％甲醇进行淋洗去除样品中的盐基质，然后用甲醇溶液进行洗脱，将洗脱液浓缩进行下一步纯化；