[发明专利]水稻基因OsFd2及其在水稻抗稻瘟病中的应用

说明书

本发明提供了一种水稻基因OsFd2及其抗稻瘟病的应用，本发明采用CRISPR/Cas9的方法对水稻基因OsFd2进行敲除，并通过过表达载体遗传转化方法进行突变体植株表型回补。分别对野生型、敲除突变体与过表达回补植株进行稻瘟病菌接种实验。结果显示，敲除OsFd2明显提高了水稻植株对稻瘟病菌的抗性，但产生苗期致死表型；而OsFd2过表达回补植株与突变体相比，生长恢复正常，表现为比野生型更感稻瘟病。上述结果表明，OsFd2为负调控水稻抗稻瘟病免疫的基因，也是水稻正常生长所必需的关键基因。本发明内容为田间稻瘟病发生时通过诱导沉默方式提高水稻抗性提供一种内源基因靶标。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻基因OsFd2及其在抗稻瘟病中的应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）是我国最重要的粮食作物，水稻的稳定高产是我国粮食安全的重要保障。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起稻瘟病长期以来都是危害水稻生产的最严重真菌病害。我国每年由稻瘟病直接造成的稻米损失高达30亿公斤，发病严重时可导致水稻减产40%-50%，甚至绝收。

植物依靠自身的免疫体系可以对外界病原微生物侵染产生快速、有效的防御反应。植物先天防御系统主要由两个层次的免疫反应组成，即病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）激发的免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI）。 在病原菌侵染植物早期，定位于植物细胞膜表面的模式识别受体，包括类受体激酶（RLKs）或类受体蛋白（RLPs），识别病原菌保守的PAMPs，从而激活PTI反应。这一层次的防御反应包括ROS（Reactive Oxygen Species）爆发、抗性基因表达、胼胝质沉积等。为突破植物的PTI防御体系，病原菌通过向植物细胞内或胞间质区分泌效应因子（effectors）以阻碍PTI的反应通路。而植物可以进一步通过一类结构保守的抗性（R）蛋白识别病原菌所产生的effectors，进而激活具有病原小种特异性且常伴有局部细胞死亡（hypersensitive response）的ETI反应。

越来越多的研究表明，叶绿体作为植物进行光合反应的细胞器也在抗病反应中发挥重要作用。叶绿体铁氧化还原蛋白（Ferredoxin，Fd）分布于基质中，是光合反应电子传递过程中最上游的可溶电子受体，负责将电子传递到下游各代谢反应通路。因此，Fd 对于调控植物细胞内的氧化还原状态起着关键作用。我们之前的研究表明，敲除拟南芥叶绿体中主要形式Fd蛋白编码基因的突变体Fd2-KO表现为对PstDC3000和白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）更为感病，且Fd2-KO在PTI激活时产生的ROS的积累水平也显著低于野生型。上述感病表型可能是由于Fd2-KO在受到病原菌侵染的情况下，体内积累高水平的茉莉酸（JA），进而抑制了水杨酸（SA）介导的抵抗活体病原菌的免疫信号通路。此外，已有报道发现，在水稻中异源表达甜椒Fd类似蛋白AP1可以增强转基因植株对白叶枯病原菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）的抗性。以上结果说明叶绿体Fd蛋白在植物免疫反应通路中发挥重要的调控作用。

截止目前，尚没有关于水稻中叶绿体Fd编码基因在水稻抗稻瘟病应用中的报道。本发明研究发现，采用生物技术手段降低水稻OsFd2的表达水平，可提高水稻抗稻瘟病能力。