[发明专利]一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法

说明书

本发明属于生物技术及植物保护学领域，更具体的说属于一种具有SPVD抗性甘薯的育种方法。本申请通过提交的构建方法，提供了一种用于培育SPVD抗性甘薯的育种方法，基于上述方法构建对应的CRISPR/Cas13载体及利用农杆菌株系EHA105侵染甘薯愈伤并诱导分化，获得了具有SPVD抗性的转基因甘薯株系，通过材料混种、毒源嫁接实验、带毒昆虫侵染等方法对转基因甘薯的抗性进行了系统验证。实验结果表明，利用该种方法可以创制出具有SPVD甘薯复合病毒病抗性的转基因甘薯，该技术也可用于其他品种、类型的栽培种甘薯用于创制具有SPVD抗性的新种质。

技术领域

本发明属于分子生物学及植物育种领域，具体设计利用分子生物学技术进行甘薯分子育种工作，从而创制出具有甘薯复合病毒病(SPVD)抗性的转基因甘薯新品种的育种方法。

背景技术

甘薯病毒病是甘薯产业面临的最为严重的病害。近年来，甘薯病毒病在全国乃至全球范围内的爆发流行造成甘薯大幅减产及难以估量的经济损失，严重影响和制约了我国乃至世界甘薯产业的发展。SPV D由两种RNA病毒共同侵染所引起，即毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)和马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)。SPVD是甘薯最为严重的病害之一，SPVD可以造成50％-98％的甘薯减产甚至绝收，是全球范围内甘薯产业的主要问题。其具体表现在当两种病毒(SPFMV/SPCSV)单独侵染甘薯时植株发病的表型并不明显或是仅仅发生轻微症状，而当SPFMV和SPCSV共同侵染甘薯后则产生了明显的病毒协生效应，进而使甘薯植株表现出严重的叶片扭曲、畸形、褪绿、明脉以及植株矮化等症状；而从病毒复制的情况来看，在协生侵染导致植株出现严重表型的过程中，SPFMV病毒拷贝数急速上升，和单独侵染甘薯时相比其拷贝上升了约600倍，SPCSV病毒拷贝数变化不明显或是略微下降。在此过程中，SPFMV是明显的受益者，SPCSV作为“辅助者”发挥功能，这和已知的绝大多数由马铃薯Y病毒参与的病毒协生现象完全不同。

SPCSV-RNase3是甘薯复合病毒病(SPVD)发病的关键原因。SPCSV除了能够与SPFMV发生病毒协生效应之外，还能与多种自然侵染甘薯的病毒发生协生作用，如黄瓜花叶病毒(CMV)、甘薯轻斑驳花叶病毒(SPMMV)等，造成严重的甘薯病毒症状和产量损失。因此，这种由SPCSV介导的病毒协生作用是SPVD导致甘薯出现严重病症及产量损失的关键因素。SPCSV-RNase3是SPCSV基因组中编码的一个Ⅲ型RNA内切酶(RNase3)，该酶与拟南芥和水稻Class 1RNAⅢ同源，具有dsRNA特异的核酸内切酶活性。Cuellar等发现包括SPFMV在内的多种RNA病毒侵染RNase3转基因甘薯后，病毒积累量与侵染野生型甘薯相比显著上升，并表现出更加严重的甘薯病症。这与自然条件下SPFMV或其它病毒与SPCSV共侵染引起的病毒协生效应极其相似。实验结果表明SPCSV介导病毒协生效应的关键机制在于其中的RNase3抑制了宿主RNA沉默机制，使甘薯清除病毒能力丧失或显著降低，从而造成SPFMV或其它病毒在细胞中过度积累，最终导致严重病症的发生。SPCSV-P22是来自于SPCSV病毒的沉默抑制子，其中SPCSV-P22仅在部分SPCSV分离物中被发现且实验结果证明虽然SPCSV-P22同样具有抑制转录后沉默的能力，但是P22在SPVD的发病过程中主要作用于增强SPCSV-RNase3抑制甘薯转录后沉默(PTGS)的能力，这表明SPCSV-P22同样不是引起SPVD病毒病的直接原因。因此，RNase3是SPCSV介导的病毒协生效应及SPVD致病的关键因子。

尚未有效防治甘薯复合病毒病SPVD的技术手段。SPVD对甘薯的种植和生产造成了极其重大的经济损失，是整个甘薯产业迫切需要解决的重大问题。但是由于SPVD病毒病研究的难度高进展慢，至今尚未发现高效的防治手段以及具有显著抗性的栽培种种质资源，抗性资源的缺失直接限制了SPVD抗性甘薯材料的育种过程。