[发明专利]非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，其特征在于，所述引物组包括：

上游引物ASFV-F：5’-CCACGGGAGGAATACCAA-3’；

下游引物ASFV-R：5’-GCAGATGCCGATACCACA-3’；

荧光探物ASFV-P：含有片段5’-TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA-3’，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

3.一种包含如权利要求1或2所述的荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

4.根据权利要求3所述的一种包含荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有125bp目的片段的重组质粒；

所述阴性对照为无核酸酶水；

所述PCR扩增液为荧光定量qPCR Mix(2×)。

5.根据权利要求4所述的一种包含荧光探针引物组的试剂盒，其特征在于，在使用时，按上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R和荧光探针ASFV-P的摩尔比为1:1:1取引物组进行混合；

所述PCR扩增液为TKARA qPCR Mix(2×)。

6.一种如权利要求3-5任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)以步骤1)中得到的总DNA为模板，利用试剂盒配制荧光反应体系进行荧光扩增；

3)利用阳性对照建立标准曲线，并分析荧光扩增产物，根据荧光扩增反应结果判定待测样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性或阴性。

7.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述荧光反应体系的组成为：总DNA、阴性对照、上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R、荧光探物ASFV-P、PCR扩增液的体积比为2μL：7.5μL：1μL：1μL：1μL：12.5μL。

8.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述荧光扩增的反应程序具体为：95℃30s，循环为95℃15s，60℃34s，共计40个循环。

9.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤3)中，建立标准曲线过程具体为：先取阳性对照稀释成终浓度为1.15×10¹⁰copise/μL的溶液，之后进行10倍系列梯度稀释再作为模板进行敏感度测定，并以此建立标准曲线，所述10倍系列梯度的浓度为1.15×10⁸～1.15×10⁰copise/μL。

10.根据权利要求6所述的一种试剂盒的应用，其特征在于，步骤3)中，质控标准为：阳性对照Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立；

结果判定：①待测样品Ct值＜35并出现、特异的S型扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；②待测样品无Ct值且无特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；③待测样品的CT值为(35,40]并出现特异的扩增曲线，判为非洲猪瘟病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取DNA，进行复检，Ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；④对于未呈现S型扩增曲线，但本底较高的待测样品，判为阴性。