[发明专利]一种巴那沉香组织培养方法

说明书

本发明公开了一种巴那沉香组织培养的方法：(1)选择外植体；(2)外植体清洗及消毒；(3)接种及培养；(4)增殖培养；(5)生根培养；(6)炼苗移栽，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。本发明系统研究植物营养组分对巴那沉香组培苗生长的影响，全面改进培养基组分和含量，培养基中额外添加了核黄素、泛酸钙、抗坏血酸、L‑半胱氨酸和叶酸。其中核黄素和抗坏血酸不仅是有机成分，还起到了减少褐化的作用；本培养方法更适合巴那沉香组织培养试管苗生长，培养所得的巴那沉香组培苗生长健壮，增殖率和生根率高，为巴那沉香规模化生产提供技术支撑。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种巴那沉香组织培养方法。

背景技术

巴那沉香(Aquilaria banaensis)是瑞香科沉香属植物，是一种热带亚热带常绿乔木，天然分布于越南的丘陵和山地，是东南亚国家生产沉香木和沉香油的主要树种。由于过度砍伐，该树种在许多天然林中已濒临灭绝。人工栽培巴那沉香是解决巴那沉香紧缺的最有效的方法，近年来广东、广西等地从越南引种栽培，但仍然面临种苗不足的问题。目前，尚未有通过组织培养进行巴那沉香繁殖的报道。

发明内容

本发明针对上述技术问题，发明一种巴那沉香组织培养的方法，旨在得到一种生长健壮、增殖率和生根率高的巴那沉香组培苗的方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种巴那沉香组织培养的方法，包含以下操作步骤：

(1)选择外植体：选择成年巴那沉香当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5天以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；

(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10分钟并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗30分钟以上，转入超净台，放入酒精中浸泡15～30s，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入1～2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡6～8min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；

(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，启动培养基为改良B5培养基中添加0.1～0.2mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L NAA和30g/L蔗糖，启动培养时间为30～40d；

(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2～0.4mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；

(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基中添加0.8～1.5mg/L IBA、0.1-0.2mg/L NAA、0.1-0.3mg/L IAA和20g/L蔗糖，生根培养30～35d，获得生根的巴那沉香组培苗；

(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根巴那沉香组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗8-10d，然后打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将巴那沉香组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将巴那沉香组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1)中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。