[发明专利]一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法

权利要求书

1.一种基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，其特征在于，步骤如下：

S1、提取cfDNA；

S2、将cfDNA片段进行末端修复并补齐；

S3、将末端补齐的DNA与测序接头进行连接，得到连接产物；

S4、通过T4-β-葡萄糖转移酶，将含叠氮修饰基团的糖UDP-6-N3-glucose的修饰基团转移到连接产物中5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

S5、在5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin；

S6、将含有上述5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；

S7、利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的DNA片段；

S8、以结合在链霉素亲和素免疫磁珠上的DNA为模板，进行PCR扩增从而制备测序文库；在制备测序文库过程中包含多个纯化步骤，选择使用磁珠法进行纯化；

S9、对测序文库进行质量检查；

S10、将含有不同barcode的测序文库按相同摩尔浓度混匀，根据二代测序仪器使用标准方法进行上机测序，获得测序结果。

2.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，其特征在于，在S2中，首先将提取的cfDNA进行片段长度检测，再将筛选的cfDNA进行末端修复并补齐。

3.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，其特征在于，在S5中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素DBCO-PEG4-Biotin。

4.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，其特征在于，在S6中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。

5.根据权利要求1所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的方法，其特征在于，在S7中，所述缓冲液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl和表面活性剂Tween20。

6.一种包括权利要求1-5任一项所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的应用。

7.根据权利要求6所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的应用，其特征在于，根据测序结果分析确定基因标志物和诊断模型的加权系数，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnostic score)，再将初步诊断分值(weighted-diagnostic score)与临床血清学指标AFP和DCP结合，获得区分肝硬化与肝癌的最终诊断分值(AD-wdscore)，使用AD-wdscore区分肝硬化与肝癌患者。

8.根据权利要求7所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的应用，其特征在于，通过偏最小二乘法和弹性网络对测序结果数据进行建模分析，得到每个模型marker的加权系数，并对样本进行打分，得到一个初步诊断分值(weighted-diagnosticscore)。

9.根据权利要求7所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的应用，其特征在于，AD-wdscore计算公式：

AD-wdscore＝0.528*log2(AFP)+0.3935*log2(DCP)+1.8577*wdscore。

10.一种用于肝癌诊断的试剂盒，包括：

a、用于测定权利要求1-5任一项所述的基于葡萄糖基修饰的测定基因标志物中5hmC含量的试剂；

b、说明书。